基于光激活自定位配体的化学-光遗传学系统

细胞的各项生理活动都离不开信号通路的传导。高时空分辨地调控特定细胞信号通路一直是化学生物学界研究的热点，而控制蛋白质的亚细胞定位又是调节信号通路的重要手段之一。目前，科学家们通常利用光遗传学与化学-光遗传学方法，借助光诱导的蛋白质异源二聚以实现特定蛋白的亚细胞定位调控。但此方法需要精确控制两种蛋白的相对表达水平，为其在复杂体系中的应用带来了较大困难。在本文中，作者设计了一种无需基于蛋白质异源二聚体的光控蛋白膜定位策略，并以此实现了高时空分辨率的细胞信号通路调节。

图 1. (a) 配体分子的结构 (b) 光控蛋白膜定位策略

此策略的设计思路如图 1 所示。作者首先合成了被 NVOC 保护的配体分子mDcTMPNVOC（图 1，a），该分子的亲脂尾端可将其定位于细胞膜内侧，并利用可被光脱除的 NVOC 基团保护三甲氧苄二氨嘧啶（TMP）。随后，作者将缀有 6 个赖氨酸的二氢叶酸还原酶（K6DHFR）与感兴趣的蛋白融合表达（图 1，b），并使用波长 405  nm 的光照射以脱去 NVOC 的保护，释放出 DHFR 的配体 TMP，从而将 DHFR 连同感兴趣蛋白一同招募至细胞膜上，达到调控目标蛋白亚细胞定位的目的。

图 2. cRaf/ERK 信号通路的调控

利用此策略，作者在 HeLa 细胞中实现了对 cRaf/ERK 信号通路的调控。cRaf 是一种定位于细胞质基质中的蛋白，当被招募至细胞膜时，cRaf 将激活激酶 ERK，使其从细胞质基质进入细胞核中，进而磷酸化报告蛋白 KTR，导致其迁移至细胞质基质中。作者于 HeLa 细胞中表达了红色荧光蛋白、DHFR 与 cRaf 的融合蛋白 miRFP670-K6DHFR-cRaf，同时一并表达的还有 KTR 与橙色荧光蛋白 mKO 的融合蛋白 ERK-KTR-mKO，利用 miRFP670 和 mKO 的荧光观察各融合蛋白的亚细胞定位情况（图 2）。当 405  nm 光照射脱笼后，mDcTMP 分子会招募 miRFP670-K6DHFR-cRaf 至细胞膜上；与预测的结果相同，受此影响，ERK-KTR-mKO 被观察到离开细胞核并进入细胞质基质中。

随后，作者设计实验证明了此策略能够在单细胞水平上实现时间可控的局部信号激活。通过在鼠的纤维原细胞 NIH3T3 中表达融合蛋白 K6DHFR-mScarlet-Tiam1，并使用激光照射细胞膜的特定区域，作者实现了 Tiam1 蛋白在细胞膜受照射区域的定位。这些 Tiam1 蛋白将刺激附近的 Rac 蛋白，从而活化 F-actin，导致周围的细胞膜向外移动。该过程可通过共表达 F-actin 的绿色荧光标记蛋白 Lifeact-mNG 予以可视化（图 3）。

图 3. 单细胞水平上时间可控的局部信号调控

此策略不仅具有较好的时空分辨率，还可实现单细胞的多通道成像。作者在 HeLa 细胞中共表达了四种具有不同颜色的融合蛋白，分别为绿色的 K6DHFR-mVenus-iSH2、红色的 mCherry-PHAkt、青色的 Akt-KTR-Turq 与紫色的 Lifeact-tdiRFP670。在 405  nm 光照 30 分钟后，K6DHFR-mVenus-iSH2 连同 iSH2 的相互作用蛋白 p110 被招募至细胞膜上。p110 是激酶 PI3K 的催化活性亚基，它可将细胞膜上的 4,5-二磷酸肌醇磷酸化为 3,4,5-三磷酸肌醇，该分子一方面将招募其报告蛋白 mCherry-PHAkt，另一方面会活化激酶 Akt，导致其报告蛋白 Akt-KTR-Turq 被磷酸化并移出细胞核。在此过程中，Lifeact-tdiRFP670 基本不受影响，故其亚细胞定位无明显变化，如图 4 所示。

图 4. 单细胞的多通路成像

最后，作者指出这一光化学调控手段不仅可将蛋白质锚定在细胞膜上长达数小时之久，还可在外加游离 TMP 分子的情况下重新释放蛋白质至细胞质基质中，因此也具有较好的可逆性。

综上所述，作者开发了一种适用于哺乳动物细胞的可逆高时空分辨率单蛋白膜定位技术，该技术借助 405 nm 光激活 TMP 与 DHFR 之间的配体-受体相互作用，将 DHFR 及其融合蛋白招募至细胞膜上。利用此技术，作者可在单细胞水平上调控涉及蛋白质膜定位的细胞信号通路，并利用多通道成像予以表征，为细胞信号通路的动态调控提供了一个全新的平台。

来源：ACS美国化学会