新研究：E3泛素连接酶NOT4A影响叶绿体的功能

来源：BioArt植物

在陆地植物中，叶绿体基因组包含约130个基因，但却编码约3000种不同的蛋白质【1】。因此，正常行使叶绿体功能不仅需要表达叶绿体编码的蛋白，还需要表达大量的核编码蛋白，这些蛋白在翻译后被导入叶绿体中。PPR（pentatricopeptide repeat domain）蛋白家族就是其中一类。它们在植物中的数量众多（拟南芥中约为450个，而在人类和酵母中则少于10个），其成员包含由35个氨基酸组成的重复序列，可促进RNA结合，使其能够调控叶绿体和线粒体的关键基因的表达【2】。通过与细胞器RNA的结合，PPR蛋白还可稳定基因转录本，促进转录后加工和蛋白翻译【2, 3】。但是，在导入叶绿体之前，PPR的表达如何受到调控却知之甚少。

E3泛素连接酶NOT4包含环指结构域（RING finger）和RNA识别基序（RNA Recognition Motif，RRM），在蛋白质的水解和RNA生物学中发挥重要作用【4-6】。研究还发现，NOT4可作为酵母中乙酰化依赖的N-degron途径的E3连接酶【7】。尽管在酵母和哺乳动物中，NOT4在共翻译控制和调控mRNA与蛋白质稳定性的核心作用已被揭示，但在植物中NOT4 E3连接酶的功能以及与PPR蛋白是否存在调控关系尚不清楚。

近日，英国伯明翰大学Daniel J. Gibbs团队在Nature Communications发表了题为The Arabidopsis NOT4A E3 ligase promotes PGR3 expression and regulates chloroplast translation的研究论文，报道了E3泛素连接酶NOT4A促进PGR3的表达调控叶绿体翻译。

在该研究中，作者首先通过BLAST分析发现，拟南芥的基因组中共编码3个与酿酒酵母ScNOT4同源的蛋白（NOT4A-C）。对突变体的表型鉴定显示，在正常的生长条件下，只有not4a突变体表现出浅黄色表型，并且发育明显延迟，光合作用受到损害。为解析not4a表型缺陷的机制，作者通过RNA-seq分析了not4a中与叶绿体功能相关的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），共鉴定到819个DEGs，包括34个PRR基因。值得注意的是，PGR3在not4a中被下调至不可检测的水平，但在N4A-G3互补系中恢复至WT水平。

进一步的，作者发现pgr3-4突变体与not4a具有相似的发育延迟和浅黄色表型。为探究PGR3是否与NOT4A同样在叶绿体翻译中发挥作用，作者检测了该突变体对林可霉素的敏感性。结果显示，pgr3-4展现出与not4a相似的超敏感性。蛋白质组学数据表明，not4a对林可霉素的敏感性可能是由于突变体中叶绿体核糖体的30S亚基耗竭所致。与not4a相似，pgr3-4突变体减少了30S叶绿体核糖体亚基RPS1和RPS7的丰度，而50S RPL2和RPL4亚基的水平与WT相当。此外，两个突变体中与30S相关的16S rRNA均显著减少。最后，从遗传角度，作者在not4a和WT的背景下构建了pPGR3::PGR3-YFP转基因株系。在PGR3蛋白水平相当的前提下，not4a背景下PGR3的转录水平比WT背景下的提高2-6倍。而且，pPGR3::PGR3-YFP/not4a可以恢复not4a的浅黄色和林可霉素敏感的表型，表明PGR3的表达需要NOT4A。

PGR3可以挽救not4a突变体中与叶绿体相关的表型缺陷

总之，该研究将在进化上保守的E3泛素连接酶、PPR蛋白表达的控制和叶绿体功能的调控三者之间建立了联系。通过促进PGR3的表达和叶绿体的翻译，NOT4A对在发育和应激反应过程中确保强大的光合作用至关重要。

参考文献

1. Zoschke, R. & Bock, R. Chloroplast translation: structural and functional organization, operational control, and regulation. Plant Cell 30, 745–770 (2018).

2.Barkan, A. & Small, I. Pentatricopeptide repeat proteins in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 415–442 (2014).

3.Manna, S. An overview of pentatricopeptide repeat proteins and their applications. Biochimie 113, 93–99 (2015).

4. Wu, Z. et al. Ubiquitination of ABCE1 by NOT4 in response to mitochondrial damage links co-translational quality control to PINK1-directed mitophagy. Cell Metab. 28, 130–144.e7 (2018).

5. Chen, H., Sirupangi, T., Wu, Z.-H., Johnson, D. L. & Laribee, R. N. The conserved RNA recognition motif and C3H1 domain of the Not4 ubiquitin ligase regulate in vivo ligase function. Sci. Rep. 8, 8163 (2018).

6. Cano, F., Miranda-Saavedra, D. & Lehner, P. J. RNA-binding E3 ubiquitin ligases: novel players in nucleic acid regulation. Biochem. Soc. Trans. 38, 1621–1626 (2010).

7. Shemorry, A., Hwang, C.-S. & Varshavsky, A. Control of protein quality and stoichiometries by N-terminal acetylation and the N-end rule pathway. Mol. Cell 50, 540–551 (2013).