Nanopore单细胞转录组测序来了！

来源：Nextomics

近日，来自法国国家科研中心的Rainer Waldmann团队在预印本bioRxiv在线公布了题为“High throughput, error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing”的研究论文。该研究报道了一种将Nanopore测序技术与UMI以及10xGenomics单细胞分离系统相结合的方法，以获得经过纠错的全长序列信息。这一方法使在单细胞水平上检测差异RNA剪接和RNA编辑成为可能。

单细胞RNA测序(scRNA-Seq)是分析细胞间异质性的一项关键技术。目前基于微流控技术的高通量scRNA-Seq方法能够快速分析成千上万个细胞，但是二代测序的短读长缺少深入了解细胞间异质性的关键信息，例如可变剪接、嵌合转录本和序列变异（SNP，RNA编辑，印迹）。长度长测序技术能够较好的克服上述限制，但是PacBio的低通量导致转录组数据覆盖不足，限制了对高表达转录本的分析。相比以上两种测序方法，Nanopore测序能够产生充足的长度长数据用于转录本分析，其较高的单碱基错误率使单细胞测序中Cell barcode（cellBC）和Unique molecular identifiers(UMI)的鉴定具有挑战性。

本研究报道了一种了可以高效可靠的将cellBC和UMI分配到Nanopore reads的策略。首先利用Illumina对10xGenomics文库进行短读长测序，为每个基因和基因组区域定义相关的cellBC，然后为每个细胞、基因或基因组区域定义相关的UMIs组合。随后利用上述信息指导cellBC和UMI分配到已经比对至基因组的Nanopore reads上。

图1 CellBC 与 UMI 分配策略

研究者使用10×Genomics制备了190和951个E18小鼠大脑细胞文库，随后分别用Illumina和Nanopore测序。UMls分子条码能够使嵌合cDNA被错误地注释为新转录本的风险降至最低。但是，先前的研究未能在单细胞纳米孔测序中使用UMls。本研究的UMl分配策略中，将97.4％的UMI分配给76％的已鉴定cellBC的Nanopore reads（图2b,c）。通过二代测序测序在单细胞中鉴定到的UMIs和基因分别有75%和82%同样在Nanopore数据集中找到，并且Nanopore与二代测序之间的基因表达相关性也很好（图2e-g）。因此，该策略cellBC和UM1指定的Nanopore数据集很好地代表了10xGenomics方法中捕获的转录组。

图2 Nanopore单细胞转录组测序。(a)Cell barcode与UMI 分配策略；(b,c)Cell barcode与UMI 分配效率(b)与准确度(c)；(d)Illumina和Nanopore数据集的UMI测序深度； (e,f)通过Illumina和Nanopore测序，检测1141个细胞的基因数量(e)和UMIs数量(f)；(g)Illumina和Nanopore测序数据之间的基因表达相关性；(h,i)Illumina基因表达(h)和Nanopore转录异构体表达(i)的t-SNE图。

Nanopore与二代测序确定的E18小鼠大脑典型的细胞类型t-SNE图显示出相似的聚类(图2 h,i)。研究者进一步寻找到139个在簇间具有差异转录异构体表达的基因，例如网格蛋白轻链A (Clta)在神经元成熟过程中经历明显的异构体转换(图3 a-d)，异构体转换可能对该蛋白在不同发育阶段的作用进行微调。

研究者通过对相同UMI的reads进行分组，来纠正Nanopore测序错误，为每个RNA分子生成一致序列，并在单个细胞内识别这种序列异质性(图3 e,f)。通过对Gria2校正后的一致性序列分析，证实了之前关于Gria2编辑的发现，并且揭示了一个位点的编辑增加了另一个位点被编辑的可能性(图3 g)。因此，单细胞长读测序既证实又扩展了之前关于中枢神经系统中Gria2编辑的知识。

图3 Nanopore单细胞转录组测序显示转录本多样性。(a-c)t-SNE图显示了神经元成熟过程中的Clta亚型表达开关；(d)两个UMIs的主要Clta剪接变异体和支持的基因组比对read；(e)Gria2的主要剪接变体；(f)R/G A->I 编辑位点放大；(g)Q/R和R/G编辑；(h)在神经元成熟期间，R / G位点的A-> I编辑扩展会增加。

综上所述，将Nanopore测序的高通量与UMI引导的校正相结合，既可以对转录异构体进行高置信度的定义，又可以在单个细胞中识别序列的异质性。利用UMIs 进行单细胞纳米孔测序(ScNaUmi-seq)将促进RNA剪接、编辑和印迹的高通量单细胞研究，也将成为深入研究肿瘤异质性的有价值的工具。

希望组自成立以来致力于三代测序技术应用于服务，自2017年搭建Oxford Nanopore测序平台便开展基于Nanopore测序技术的研发工作，先后突破ONT Ultra-long测序、ONT微量建库、ONT全长转录组测序等前沿技术。希望组将继续深耕Nanopore测序技术，为全球客户提供快速、高效的纳米孔长读长测序服务！

参考文献：

Lebrigand K, Magnone V, Barbry P, et al. High throughput, error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing[J]. bioRxiv, 2019: 831495.