刘耀光院士团队开发高效、广靶向的植物胞嘧啶碱基编辑器PhiCBEs ​

来源：BioArt植物

基于CRISPR/Cas系统开发的胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）和腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）不需要供体模板以及不产生双链DNA断裂的条件下分别实现C-T（G-A）或A-G（T-C）的碱基精准替换，为基因功能研究和遗传改良提供了有效工具。

近日，华南农业大学生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光院士研究团队在Molecular Plant在线发表了题为 PhieCBEs: Plant High-efficiency Cytidine Base Editors with Expanded Target Range 的研究论文，成功开发了一套高效、广靶向的植物胞嘧啶单碱基编辑器PhieCBEs (plant high-efficiency CBEs)。目前已有的不同世代版本的CBE系统（BE1、BE2、BE3和BE4等）在植物细胞中的编辑效率普遍不高，且采用的来自大鼠的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1的CBE对靶点序列具有偏好性，即更易于编辑TC、CC位点（下划线为被编辑碱基），而几乎不编辑GC位点，因此编辑效果极不稳定。采用来自七鳃鳗鱼的PmCDA1脱氨酶和来自人的APOBEC3A脱氨酶（hA3A）的编辑器在一定程度上提高了植物单碱基编辑效率和扩大了编辑窗口。此外，一种基于靶向差异sgRNAs的代理报告系统DisSUGs，也提高了植物单碱基编辑效率。目前大多数CBE系统是使用融合识别NGG-PAM的Cas9n变体，因此降低了基因组靶点的选择自由度。这些因素限制了单碱基编辑器在植物中的广泛应用。尽管Thuronyi等人利用噬菌体辅助连续进化获得了功能更强的进化型胞嘧啶脱氨酶（如evorAPOBEC1，evoFERNY和evoCDA1等），并与Cas9n变体融合开发了evoBE4max类型编辑器，实现了哺乳动物细胞中的无靶序列偏好性的高效胞嘧啶碱基编辑。但是，仍不清楚这些进化型脱氨酶与靶点选择性更广泛的Cas9n-NG（识别NG-PAM）变体构成的CBE在植物中是否有效。

刘耀光院士团队根据水稻密码子偏好性重新优化了evorAPOCBEC1、evoFERNY、evoCDA1和hA3A的核苷酸序列，并将这些脱氨酶基因序列与Cas9n-NG基因融合，并在两端加入更高效的核定位信号bpNLS，构建了四个高效的植物胞嘧啶单碱基编辑器PhieCBEs（PevorAC1-NG、PevoFERNY-NG、PevoCDA1-NG和PhA3A-max-NG）；另外，将高保真eCas9变体进一步突变成一种新的eCas9n-NG变体（识别NG-PAM），与evoCDA1融合构建了一个新的PhieCBE PevoCDA1-eNG。以这些PhieCBEs对水稻的9个靶位点（含有NG-PAM或NGG-PAM）进行了系统的编辑效率和特征测试。结果显示，PhieCBEs和一种BE4编辑器（rAC1-NG）对照相比，其平均编辑效率提高了3~8倍，并消除了碱基序列环境的偏好性，展现不同宽度的编辑窗口，和具有较低的T-DNA自靶向突变效率。其中， PevoFERNY-NG表现最突出，在NGG-PAM和NG-PAM靶点都有较高的编辑效率（40.6~82.7%，平均为62.6%），主要编辑窗口为C3~C8，产生较少的非C-T编辑副产物（2.9%），并有较低的T-DNA自靶向突变效率（6.9%）。

PhieCBEs载体的结构（A）和编辑效率（B）

综上，该研究开发的PhieCBEs系统（特别是PevoFERNY-NG）具有高效、广靶向、无靶序列偏好性、编辑窗口广和自靶向编辑效率低等优点，使单碱基编辑系统在植物中具备了实用性，能够广泛地用于基因功能研究、基因的饱和突变、编辑调控元件、引入提前终止密码子、和可变剪接等研究，为植物功能基因组研究和作物遗传改良提供了有力的工具。