新型编辑编辑器-dCpf1胞胞嘧啶单碱基编辑的全基因组脱靶效应分析

来源：植物科学最前沿

CRISPR 介导的单碱基编辑（CBEs和ABEs）包括（i）由催化缺失的Cas9或Cpf1组成的DNA结合模块和（ii）工程化的胞嘧啶或腺嘌呤脱氨酶。单碱基编辑器在不造成DNA双链断裂（DSB）的情况下，能够将一个非PAM单链中DNA进行 C-T或A-G的转换。碱基编辑器已被广泛应用于纠正真核细胞和整个生物体内的点突变或诱导单核苷酸转换。催化失活的Lachnospiraceae细菌Cpf1（dLbCpf1；又称dLbCas12a）-BE是最近通过将dLbCpf1与胞嘧啶脱氨酶APOBEC1连接而形成的碱基编辑器。由D10A SpCas9 nickase和APOBEC1组成的base editor 3（BE3）识别的PAM序列为NGG，并在窗口4-8位诱导C-T转换，而dLbCpf1-BE识别TTTV-PAM序列，并在8-13位催化C-T转换。Cpf1介导的碱基编辑器拓宽了胞嘧啶脱氨酶可靶向范围。
近日韩国基础科学研究院（IBS）基因组编辑中心的Jin-Soo Kim团队在Nature Communications上发表了题为“Genome-wide specificity of dCpf1 cytidine base editors”的文章。提出通过全基因组测序在体外鉴定由dCpf1介导的单碱基编辑器造成的全基因组脱靶位点。

作者首先用靶向深测序比较了9个人类基因组靶位点（CDKN2A、RUNX、FANCF、EMX1、DNMT1、LINC01551、DYRK1A、BCL2L13和CLIC4）的LbCpf1核酸酶的插入和缺失（indel）频率和dLbCpf1 BE的碱基编辑频率。发现dLbCpf1 BE的单碱基编辑活性与LbCpf1核酸酶的indel活性相关性较差。
然后比较了LbCpf1和dLbCpf1 BE对靶标crRNAs的错配容忍度。错配容忍度越高越容易造成脱靶。作者用dLbCpf1 BE和LbCpf1与靶位点分别含有0到4个碱基错配的crRNAs处理HEK293T细胞，通过靶向深度测序，分别测量了单核苷酸替换和小片段indels产生频率。尽管dLbCpf1 BE来源于LbCpf1，但在某些位点，dLbCpf1 BE和LbCpf1核酸酶对不匹配的crRNAs的耐受性不同，鉴于这些结果，作者预计dLbCpf1 BE和LbCpf1核酸酶将在人类基因组中引起不同的脱靶效应。因此，需要一种无偏差的方法来评估dLbCpf1 BE的全基因组特异性。

图1：dLbCpf1 BE和LbCpf1对crRNA的错配容忍度。

作者首先把HEK293T细胞中纯化的基因组DNA与含有纯化dLbCpf1 BE蛋白的RNP复合物和靶向DYRK1A的体外转录的crRNA一起培养，以诱导靶位点的C-to-U转化，然后用USER（一种用于去除尿嘧啶的大肠杆菌尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）和DNA糖基化酶裂解酶内切酶VIII）去除dLbCpf1 BE生成的尿嘧啶，从而导致DNA SSBs，对产生的SSB进行WGS。然后利用生物信息学分析，通过修改后的Digenome-seq确定了20个潜在的非靶点。为了检查Digenome-seq的重复性，又使用dLbCpf1 靶向BEDYRK1A独立执行了两次Digenome-seq，发现两个不同的实验捕获了相同的17个位点，包括靶位点。这些实验证明，可以用高重复性的Digenome-seq来识别dLbCpf1的脱靶位点。通过对预测的脱靶位点深测序验证，发现Digenome-seq可以识别出dLbCpf1碱基编辑频率低至0.1%的脱靶位点，说明dLbCpf1介导的Digenome-seq是一种高度灵敏的鉴定方法。然后，作者在dLbCpf1 BE的胞苷脱氨酶结构域中引入突变（在胞苷脱氨酶结构域中含有W90Y + R126E突变），发现dLbCpf1-BE-YE1显示出更高的碱基编辑特异性，比dLbCpf1 BE高出15倍。

在这项研究中，作者优化了Digenome-seq来评估dLbCpf1-BE的全基因组特异性，并预测这种方法将被广泛应用于评估dCpf1胞苷碱基编辑器的全基因组的脱靶效应。为了全面了解dLbCpf1 BE的脱靶效应，需要进一步的研究来确定在没有crRNA的情况下的靶外效应。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-020-17889-9