ABE单碱基编辑器改造：变身CBE特异性编辑TC序列中的胞嘧啶

2017年哈佛大学David Liu实验室开发的单碱基编辑器ABE（Adenine Base Editor）可实现A·T--G·C碱基对的转换，理论上可治疗近半数点突变遗传病，因而在基因治疗领域有广阔的应用前景【1】（详见BioArt报道：突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC）。不过，近年来研究者发现ABE在RNA水平有明显的脱靶效应，因而存在安全风险【2-4】（详见BioArt报道：专家点评Nature | 杨辉/郭帆/李亦学等开发更高精度的单碱基基因编辑工具，全面降低RNA脱靶风险）。此外，研究发现ABE系统还能编辑部分位点上的胞嘧啶（C）（详见BioArt报道：NBT | ABE单碱基编辑器的新风险——介导胞嘧啶的脱氨基化）【5-8】，这进一步增加了ABE应用时的安全风险。不过ABE编辑胞嘧啶（C）的能力是否可被用于构建有特殊用途的CBE，从而变风险为机遇？

2021年7月1日，来自韩国汉阳大学化学系的Sangsu Bae实验室与首尔大学的Jae-Sung Woo实验室合作在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Adenine base editor engineering reduces editing of bystander cytosines的论文，通过对腺苷脱氨酶TadA进行点突变筛选，实现了对ABE系统的改造与优化。文章指出，TadA中的D108Q点突变可大幅降低ABE系统编辑胞嘧啶（C）的能力，从而提升了ABE的安全性。更重要的是，研究者还发现，TadA中的P48R突变可以让ABE变身高特异性的CBE工具，能特异性的编辑TC序列中的胞嘧啶（C），实现TC-TT或TC-TG的转变。

此前的研究指出，ABE能编辑位于sgRNA位点5-7位（PAM为21-23位）的TC*N序列中的胞嘧啶（C）【8】。近年来研究者开发出多种ABE突变体以改善其活性并在RNA水平的脱靶效应，这些突变体是否依然能编辑胞嘧啶（C）？为此本研究对此进行了综合分析。结果发现所有的ABE突变体均能编辑胞嘧啶（C），不过部分点突变如F148A和V106W能减弱ABE编辑胞嘧啶（C）的能力，这表明对ABE进行改造以改变其编辑不同碱基的能力是可行的。

为找到能改变ABE编辑胞嘧啶（C）能力的关键氨基酸位点，研究者对不同物种的腺苷脱氨酶TadA进行了同源性分析，结果发现其它物种中常存在P48R和D108N/E/S突变。结合已有的saTadA的结构信息，研究者从P48、D108、F149A、V30、F84等多个位点入手对ABE进行改造。经过一系列筛选，研究者发现D108Q能明显降低TadA7.10编辑胞嘧啶（C）的能力，但对其编辑腺嘌呤（A）的能力影响不明显；P48R则签好相反，可显著降低TadA7.10编辑腺嘌呤（A）但增强其编辑胞嘧啶（C）的能力。因此，通过D108Q和P48R两种不同的突变，研究者可以改变ABE系统对A和C两种碱基的偏好性。

随后研究者还证实，D108Q同样可增强其它ABE突变体如TadA8e和TadA8.17编辑腺嘌呤（A）的特异性，此外，D108Q可与V106W或F149A等点突变共存，多种点突变的结合更好的提升ABE系统的特异性并降低其在RNA水平的脱靶效应。

考虑到P48R点突变让ABE具备了CBE的特性，研究者在TadA7.10-P48R的C末端融合两份拷贝的UGI（命名为ABE-P48R-UGI），并对ABE-P48R和ABE-P48R-UGI编辑胞嘧啶（C）的能力进行了系统分析。结果显示ABE-P48R和ABE-P48R-UGI能特异性的编辑5-7位TC序列中的胞嘧啶（C），最终实现TC-TT和TC-TG的转变。研究者还指出，ABE-P48R和ABE-P48R-UGI对>10%的致病性TT-TC和TG-TC点突变有修复能力，因而在基因治疗中具有不错的应用前景。

总体而言，本研究从ABE可编辑胞嘧啶（C）的特性出发，通过腺苷脱氨酶TadA的点突变筛选对ABE进行了升级改造：一方面通过D108Q点突变抑制ABE编辑胞嘧啶（C）的能力，提升了ABE工具的特异性和安全性。另一方面则反其道而行之，通过P48R点突变获得可特异性编辑TC序列中胞嘧啶（C）的新型CBE。这一研究让我们对单碱基编辑工具有了更全面的认识，也让单碱基编辑工具的改造有了新的思路。

来源： BioArt植物