ABE单碱基编辑器改造:变身CBE特异性编辑TC序列中的胞嘧啶

BioArt植物  |   2021-07-26 08:34

2017年哈佛大学David Liu实验室开发的单碱基编辑器ABE(Adenine Base Editor)可实现A·T--G·C碱基对的转换,理论上可治疗近半数点突变遗传病,因而在基因治疗领域有广阔的应用前景【1】(详见BioArt报道:突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC)。不过,近年来研究者发现ABE在RNA水平有明显的脱靶效应,因而存在安全风险【2-4】(详见BioArt报道:专家点评Nature | 杨辉/郭帆/李亦学等开发更高精度的单碱基基因编辑工具,全面降低RNA脱靶风险)。此外,研究发现ABE系统还能编辑部分位点上的胞嘧啶(C)(详见BioArt报道:NBT | ABE单碱基编辑器的新风险——介导胞嘧啶的脱氨基化)【5-8】,这进一步增加了ABE应用时的安全风险。不过ABE编辑胞嘧啶(C)的能力是否可被用于构建有特殊用途的CBE,从而变风险为机遇?

2021年7月1日,来自韩国汉阳大学化学系的Sangsu Bae实验室与首尔大学的Jae-Sung Woo实验室合作在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Adenine base editor engineering reduces editing of bystander cytosines的论文,通过对腺苷脱氨酶TadA进行点突变筛选,实现了对ABE系统的改造与优化。文章指出,TadA中的D108Q点突变可大幅降低ABE系统编辑胞嘧啶(C)的能力,从而提升了ABE的安全性。更重要的是,研究者还发现,TadA中的P48R突变可以让ABE变身高特异性的CBE工具,能特异性的编辑TC序列中的胞嘧啶(C),实现TC-TT或TC-TG的转变。

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此前的研究指出,ABE能编辑位于sgRNA位点5-7位(PAM为21-23位)的TC*N序列中的胞嘧啶(C)【8】。近年来研究者开发出多种ABE突变体以改善其活性并在RNA水平的脱靶效应,这些突变体是否依然能编辑胞嘧啶(C)?为此本研究对此进行了综合分析。结果发现所有的ABE突变体均能编辑胞嘧啶(C),不过部分点突变如F148A和V106W能减弱ABE编辑胞嘧啶(C)的能力,这表明对ABE进行改造以改变其编辑不同碱基的能力是可行的。

为找到能改变ABE编辑胞嘧啶(C)能力的关键氨基酸位点,研究者对不同物种的腺苷脱氨酶TadA进行了同源性分析,结果发现其它物种中常存在P48R和D108N/E/S突变。结合已有的saTadA的结构信息,研究者从P48、D108、F149A、V30、F84等多个位点入手对ABE进行改造。经过一系列筛选,研究者发现D108Q能明显降低TadA7.10编辑胞嘧啶(C)的能力,但对其编辑腺嘌呤(A)的能力影响不明显;P48R则签好相反,可显著降低TadA7.10编辑腺嘌呤(A)但增强其编辑胞嘧啶(C)的能力。因此,通过D108Q和P48R两种不同的突变,研究者可以改变ABE系统对A和C两种碱基的偏好性。

随后研究者还证实,D108Q同样可增强其它ABE突变体如TadA8e和TadA8.17编辑腺嘌呤(A)的特异性,此外,D108Q可与V106W或F149A等点突变共存,多种点突变的结合更好的提升ABE系统的特异性并降低其在RNA水平的脱靶效应。

考虑到P48R点突变让ABE具备了CBE的特性,研究者在TadA7.10-P48R的C末端融合两份拷贝的UGI(命名为ABE-P48R-UGI),并对ABE-P48R和ABE-P48R-UGI编辑胞嘧啶(C)的能力进行了系统分析。结果显示ABE-P48R和ABE-P48R-UGI能特异性的编辑5-7位TC序列中的胞嘧啶(C),最终实现TC-TT和TC-TG的转变。研究者还指出,ABE-P48R和ABE-P48R-UGI对>10%的致病性TT-TC和TG-TC点突变有修复能力,因而在基因治疗中具有不错的应用前景。

总体而言,本研究从ABE可编辑胞嘧啶(C)的特性出发,通过腺苷脱氨酶TadA的点突变筛选对ABE进行了升级改造:一方面通过D108Q点突变抑制ABE编辑胞嘧啶(C)的能力,提升了ABE工具的特异性和安全性。另一方面则反其道而行之,通过P48R点突变获得可特异性编辑TC序列中胞嘧啶(C)的新型CBE。这一研究让我们对单碱基编辑工具有了更全面的认识,也让单碱基编辑工具的改造有了新的思路。

来源: BioArt植物

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