研究发现RNA剪接基因编辑的新方法

　　常兴研究组过去开发TAM (Targeted AID-induced mutagenesis)，也就是融合核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶AID，并且发现它具有两个特点。

首先，可以在sgRNA靶向的DNA上，将C/G碱基随机向其它碱基突变，可以用于分析肿瘤耐药性突变及诱导蛋白体外进化等；其次，在偶联UNG抑制剂UGI后，可以在将sgRNA靶向区域中一个小窗口内（5-6个碱基）的C高效向T突变 (Nature Methods, 2016)。

　　在这一新研究中，博士研究生袁娟娟和马云青首先注意到，98%以上的内含子有保守的GU（内含子开始）和AG（内含子末尾）序列，推测如果可以高效精确地将G突变成A，可以特异性阻断外显子识别，调控内源性mRNA的剪切。

通过这一策略，利用TAM诱导剪接位点DNA上G>A突变，就可以诱导可变外显子(alternative exon)及组成性外显子(constitutive exon)的跳读 (Exon skipping)；改变可变剪接位点的选择(Alternative splice site)；调节互斥外显子的选择(mutually exclusive exons)；诱导小的内含子的包含 (intron retention)。

此外，如果通过TAM将３’剪接位点上游polypyrimidine track中包含的C向T突变，可以促进下游外显子的包含。因此，利用TAM可以成功地实现针对RNA剪接的“loss of function”和”gain of function”调控。

　　最后，研究人员探索了利用TAM修复杜氏肌营养不良症（DMD）的可行性。DMD是一种致命的遗传疾病（发病率男性中1/4000）。其发病原因在于，遗传突变造成Dystrophin蛋白的完全缺失，引发肌肉萎缩和瘫痪，最终造成心脏或肺功能的衰竭。

如果通过外显子跳读，能产生内部截短的Dystrophin蛋白，可以达到对DMD的治疗效果。因此研究人员构建了DMD病人来源的诱导型多能干细胞，此病人因为外显子删除造成Dystrophin蛋白的完全缺失。通过在剪接位点诱导G>A的突变，研究人员实现了目标外显子的完全跳读，在所有表达TAM的细胞中恢复了Dystrophin的蛋白表达，修复了心肌细胞的缺陷。

　　该研究得到科技部、国家自然科学基金委、中科院先导计划和上海市科委相关项目的资助。

　　论文链接 

TAM 融合蛋白高效调控外显子跳读、互斥外显子选择、可变剪接位点选择和内含子包含