Nat Biotech丨提高CRISPR特异性的新方法

来源：BioArt

撰文 | 福小姐

CRISPR-Cas基因编辑系统在基因和细胞治疗方面展现出巨大的应用前景。但是，脱靶效应（off-target effects），即在与间隔序列（spacer）不完全互补的位点发生DNA意外断裂，仍是CRISPR-Cas系统从基础研究走向临床应用道路上亟待解决的关键问题。因此，提高CRISPR-Cas系统的特异性十分重要。

目前，针对II型CRISPR系统，主要有两种用于提高SpCas9特异性的策略：1. 通过两个Cas9蛋白分子配位结合构建AND逻辑门（AND Gate）【1】；2. 利用Cas9-sgRNA复合物降低DNA定位的能量，提高系统整体特异性【2】。这两种策略均取得了不错的效果，但仍有不少局限性。最近，也有学者利用定向进化策略得到不同SpCas9蛋白突变体来提高该核酸酶的特异性【3】，但是该方法的通用性仍需进一步探究。

2019年4月15日，来自美国Duke大学生物医学工程系的CharlesA. Gersbach课题组在Nature Biotechnology期刊上在线发表了题为Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures的研究性论文，提出了一种简单、通用的方法，即通过设计sgRNA二级结构来提高CRISPR系统的特异性。

作者在sgRNA的5’末端延伸出一个hairpin发卡结构（hp-sgRNA），将该结构引入到间隔序列（the spacer）上。这一发卡结构可以作为R-loop形成的空间位阻和能量壁垒。作者认为，通过调节sgRNA二级结构的强度，R-loop可在on-target位点形成；而在off-target位点，由于RNA-DNA错配，R-loop形成受阻。R-loop的形成是SpCas9构象改变、激活的关键步骤。因此，阻碍off-target位点R-loop的形成，可有效抑制SpCas9在off-target位点的活性，从而实现CRISPR系统特异性的提高。

为了验证上述理论，作者设计了一系列不同参数的hp-sgRNAs序列，包括stem位置、stem长度、loop位置以及用非完美配对的rG-rU碱基对替代rG-rC/rA-rU。同时，作者还设计了无结构的sgRNAs（non-structured sgRNAs，ns-sgRNAs）作为对照，如图1。

作者首先测试了hp-sgRNA二级结构对Cas9结合DNA能力的影响。作者将不同sgRNA序列和dCas9-P300转录激发因子转染至细胞，通过检测靶向的内源基因活性来测定dCas9对目标DNA的结合能力。如图2所示，hp-sgRNAs间隔序列延伸长度与dCas9结合靶标DNA能力呈负相关关系。与hp-sgRNAs相比，对照组ns-sgRNAs降低转录活性的能力很低，表明影响dCas9结合靶标DNA能力的是hp-sgRNAs的发卡结构而非简单的序列延长。

图2

随后，作者利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术和模拟计算证明了间隔序列的二级结构是通过调节R-loop的入侵动力学和稳定性来影响dCas9的结合活性。

在此基础上，作者评估了所设计的间隔序列二级结构是否可以有效提高SpCas9核酸酶特异性。作者选取了包含大量off-target位点的间隔序列，并比较了hp-sgRNAs、WT-sgRNAs（未延伸sgRNAs）和tru-sgRNAs（truncated sgRNAs）在on-target位点和off-target位点的插入缺失（indel）率。如图3所示，与WT-sgRNAs相比，hp-sgRNAs设计具有相当的靶向活性；与tru-sgRNAs相比，hp-sgRNAs具有更低的脱靶率。作者用靶标位点突变率除以所有脱靶突变率的总和来定量特异性，结果表明，所有优化的hp-sgRNAs均显著提高了SpCas9的特异性。

图3

最后，作者验证了这种hp-sgRNAs设计可以进一步应用于SaCas9和Cas12a核酸酶，以提高其特异性。与未修饰sgRNAs和ns-sgRNAs相比，hp-sgRNAs将核酸酶的特异性分别提高了55倍和9倍，如图4。

图4

综上，Charles A. Gersbach教授课题组通过在间隔序列上设计发卡结构来有效抑制R-loop的形成，限制Cas核酸酶在off-target位点的构象变化和激活，从而达到提高CRISPR系统特异性的目的。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0095-1

制版人：子阳

参考文献

1. Tsai, S. Q. et al.Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specifc genome editing. Nat. Biotechnol. 32, 569–576 (2014).

2. Tsai, S. Q. et al.Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specifc genome editing. Nat. Biotechnol. 32, 569–576 (2014).

3. Casini, A. et al. Ahighly specifc SpCas9 variant is identifed by in vivo screening in yeast. Nat. Biotechnol. 36, 265–271 (2018)