工程CRISPR核酸酶DNA结合特性、切割的特异性及脱靶效应

来源：植物科学最前沿

工程Cas9变体（SpCas9s）和酸性氨基球菌种Cas12a（AsCas12a）在细胞中的脱靶现象比酿脓链球菌Cas9（SpCas9）少。目前，核酸酶的特异性是根据靶标和脱靶基因组位点的DNA断裂修复疤痕来推断的。此类脱靶检测策略无法将酶内在动力学参数与核酸酶递送方法、暴露时间、遗传背景、细胞周期阶段或DNA断裂修复途径等因素区分开。大多数基于体外下一代测序（NGS）的策略还旨在在基因组中找到假定的脱靶位点，但是它们比较reads数而不是动力学速率，并且无法识别DNA末端或其加工动力学。为了直接测定和预测这些酶的特异性，需要在系统的脱靶DNA序列文库中比较脱靶结合亲和力和切割动力学。

最近，德克萨斯大学奥斯汀分校的 Ilya J. Finkelstein 团队在Nature Biotechnology上发表了题名为“Massively parallel kinetic profiling of natural and engineered CRISPR nucleases”的研究论文，主要建立了一个新的实验平台，该平台可以全面测量合成DNA文库中DNA结合和切割特异性去检测CRISPR-Cas核酸酶。

NucleaSeq是一个快速、大规模平行的体外平台，能够测量CRISPR-Cas核酸酶的裂解动力学。NucleaSeq捕获了引导RNA（gRNA）匹配和错配的DNA序列的大型文库的切割产物的时间分辨身份。通过芯片杂交的关联作图平台（CHAMP）在重新设计的NGS MiSeq芯片上测量了这些文库的核酸酶结合特异性。结合NucleaSeq和CHAMP，研究人员评估了五个SpCas9变体和Cas12a的DNA，这些DNA包含gRNA相关的错配、插入和缺失（图1）。工程Cas9s，特别是Cas9-HF1，增加了切割特异性，但没有增加结合特异性。令人惊讶的是，虽然Cas12a在细胞中具有较高的切割特异性，但它在体外具有与wtCas9相似的特异性。最初的DNA切割位点和随后的末端修饰会随核酸酶、gRNA和RNA–DNA错误配对的位置而变化。有趣的是，PAM远端RNA-DNA错配会通过核酸酶末端修饰产生不相容的DNA末端，但不会减慢整体切割速率（图2）。

总的来说，研究人员使用大量数据去开发了一个生物物理学模型，该模型提供了比较CRISPR核酸酶的定量框架，并揭示了脱靶切割的机理见解。更广义的层面上来说，NucleaSeq和CHAMP能够对工程核酸酶和天然核酸酶的特异性和裂解产物进行快速、定量和系统的比较。

图1：整合NucleaSeq和CHAMP的平台概观。

图2：CRISPR-Cas核酸酶切割的统计建模。