绝对定量与相对定量，如何测量非小细胞癌线粒体膜电位？

来源：BioArt

今年初，BioArt曾报道加州大学David B. Shackelford研究组在Nature上所发表的文章题为In vivo imaging of mitochondrial membrane potential in non-small-cell lung cancer，提供了能够在体内测量非小细胞肺癌细胞线粒体电势的新技术，为活体癌症线粒体氧化磷酸化研究提供了重要的工具（Nature | 非小细胞肺癌线粒体膜电位活体成像）。

该文章发出后，引发了大家的广泛关注。但是关于文章中线粒体膜电位的测量方法受到了哈佛医学院Nathaniel M. Alpert研究团队的质疑，他们将自己的质疑以Matters arising形式发表了文章In vivo quantification of mitochondrial membrane potential，针对Shackelford研究组的工作中的计算方法提出了新的见解。

Shackelford研究组的工作展示了不同肺癌亚型小鼠线粒体代谢差异【1】，但是Alpert研究团队提出的疑问认为在该文章中线粒体膜电位感应示踪剂的测量和计算方面存在疏漏。利用放射性标记正电子发射断层扫描(Positron emission tomography, PET)进行线粒体膜电位(ΔΨm)的成像原理探针是基于台式设备的体外测量方法。几十年来，体外测量ΔΨm的主要使用各种亲脂性阳离子比如3H-TPP+【2-4】。在各种测量情况下，需要使用能斯特方程来将探针在膜两边的平衡浓度与跨膜电势联系起来。最重要的是，能斯特方程只有在探针浓度处于平衡即膜两边的浓度不随时间变化时才有效。Shackelford研究组认为他们使用一种电压敏感PET示踪剂18F-BnTP可以在体内测量非小细胞肺癌的线粒体膜电位【1】，但是Alpert研究团队认为他们的工作并没有测量线粒体膜电位。

Alpert研究团队认为Shackelford他们的工作是基于经验终点数值（Empirical endpoint），也就是说使用的方法是以心肌内的百分比剂量对数据进行归一化测量。18F-BnTP的剂量百分比是时间依赖的、几个生理变量相关的函数，其中涉及到的生理变量包括时间和一些生理变量的函数,包括18F-BnTP水平、胞外空间体积分数(Extracellular space, ECS)、细胞的膜电位ΔΨm等。Alpert团队的研究表明，在18F-TPP+和18F-BnTP等放射性示踪剂的长期平衡中，可以得到一个以毫伏(mV)为单位的唯一绝对数值（Absolute endpoint）。Alpert团队证明，在稳定状态下，组织中的示踪剂浓度几乎线性地依赖于胞浆中示踪剂浓度、线粒体和胞外体积分数，但指数地依赖于细胞和线粒体膜电位之和（图1）。

图1 Alpert团队研究证明得到的组织中示踪剂浓度计算函数

先前Alpert团队发现，大剂量注射18F-TPP+后血浆示踪剂浓度呈单调下降趋势，这意味着示踪剂的剂量指数不是恒定常数，这可能会影响该终值的可靠性及其在研究和临床转化中的有效性。Shackelford研究组的工作中虽然使用线粒体标记物TOM12在两种癌症亚型中显示了相似的线粒体密度，但是并没有考虑其他关键变量。而且膜电位的充分定量需要测量平衡组织和胞浆浓度，而不能像Shackelford研究组的工作中仅仅通过一次性注射放射性示踪剂和延迟成像来实现。

但是Shackelford研究组的工作并非全无可取之处，他们的工作增加了支持线粒体作为肿瘤体内状态评估潜在作用的证据。同时他们也提出膜电位成像可能会成为测量线粒体活动在衰老、生理以及疾病状况下重要工具。但是必须提出的一点是，想要将示踪剂18F-BnTP等成功的应用于人类研究并最终付诸临床，精确的和可重复的量化过程是必须的。这只能通过更为适当的技术以及对所有关键变量的综合、全面的考虑才能实现。

针对这些质疑，Shackelford研究组进行了回应。Shackelford研究组表示他们所使用的亲脂性阳离子示踪剂18F-BnTP在小鼠模型中可以很好地作为肿瘤中线粒体活性成像的工具，而且可以确定不同肺肿瘤亚型中线粒体功能的差异。Shackelford研究组表示该工作是建立的多个研究组包括Alpert团队先前的工作之上的【5】，而且的确证明了18F-BnTP在组织内的积累对跨线粒体内膜的电压有响应，使测量诸如心脏等组织中线粒体膜电位的相对变化成为可能

18F-BnTP示踪剂在组织中的吸收随线粒体内膜和质膜电压的增加而增加，这一点已被充分证实。然而，将这种摄取与电压联系起来是有挑战性的，因此Shackelford研究组在小鼠注射18F-BnTP 示踪剂60分钟后对其进行成像，以确保每只小鼠都尽可能接近稳定状态。此时能够清楚显示肿瘤内示踪剂吸收的变化。虽然获取多个样本和动力学成像分析会很有趣，但它将增加的价值有限而且对现有研究范围内进行推广应用是不切实际的。进一步的计算机断层扫描成像测量胞外体积分数和血浆示踪剂浓度研究以更好地量化膜电位的这一想法虽然有吸引力，但实际情况很难操作而且也不能转化为临床方面可以使用的方法。虽然这些额外的测量会部分地促进线粒体膜电位绝对定量，但这并非必要选择。

剩下的争论在于两个团队对线粒体膜电位的定量测量的描述。Shackelford研究组表示Alpert团队的质疑是正确的，因为在最初的论文中他们并没有直接以毫伏为单位去直接测量线粒体膜电位。但是Shackelford研究组给出了他们自己的想法，他们认为在最初的论文中他们测量了肺肿瘤中18F-BnTP的相对摄取，并将其归一化为在心脏中示踪剂的摄取。

测定的18F-BnTP摄取的变化反映了在规定时间内大量注射PET配体后线粒体和细胞膜电位的变化。该方法类似于利用染料在线粒体内以电压依赖方式积累的体外细胞培养测定线粒体膜电位的相对变化。在这些测定中，线粒体膜电位的绝对值很难从荧光强度测量中推断出来，因为能斯特方程的应用需要测量许多其他细胞参数，这些参数的确定具有挑战性。但是，Shackelford研究组他们对于线粒体膜电位的相对差异是以任意单位（Arbitrary units，a.u.）来表示。mV或a.u单位的变化反映了线粒体膜电位的差异。将这种稳健的方法应用到的体内工作中，虽然Shackelford研究组他们没能给出肺肿瘤线粒体膜电位的绝对测量值，但是已经测量了肺肿瘤与心脏组织中示踪剂摄取的比率。从本质上说，两个团队所争论的问题可以简化为最初的论文中其实进行的是对“变化值”测量和量化，而不是线粒体膜电位的绝对值。使用这种方法，Shackelford研究组能够准确地推断出不同肺肿瘤亚型中18F-BnTP摄取的变化，反映了线粒体膜电位的变化。

18F-BnTP是肺癌小鼠模型中线粒体生物学体内研究的有价值的工具，但是想要将18F-BnTP临床转化为人类所用还需要更多的研究。18F-BnTP等探针的临床转化需要综合考虑其他变量、严格的可行性研究以及多学科之间的合作。最重要地，两个研究团队对于推动线粒体功能研究的严谨的精神值得我们在日常的研究中加以运用，公开的讨论和相互的尊重是解决学术分歧、推动科学进步的重要态度。