【分析】基于FRET机理构建比率荧光探针用于线粒体膜电位双色成像

来源：X一MOL资讯

线粒体膜电位(MMP)在信号转导、细胞凋亡、线粒体功能紊乱等生理、病理过程中起重要作用。因此，实时原位研究细胞或活体组织内MMP的动态变化有着重要的生理学和病理学价值。在研究活细胞或活体组织中MMP水平的众多方法中，荧光成像法具有操作简便、低损伤的优点，能够在活细胞和活组织中实现实时、原位的观测，因此是用来研究MMP理想的方法，但是这种方法需要使用相应的荧光探针。MMP荧光探针的构建具有较高的难度，故构建新型MMP荧光探针的相关文献非常少，且商品化的相关探针也很少。

目前使用的MMP荧光探针存在以下问题，(1)单发射MMP荧光探针：此类荧光探针都是根据荧光强度对MMP的变化做出响应，荧光波长不随MMP动态行为而变化。因此，使用这类探针进行荧光成像时，染色区域不均匀和激发光源功率的波动往往会对MMP的研究带来较大的干扰，不利于定量分析；(2)双发射MMP荧光探针：这类探针只有美国分子探针公司商业化产品JC-1和JC-9，用JC-1和JC-9进行细胞孵育染色，当染色浓度稍低时，此探针很难形成聚集态，当染色浓度稍高时，又因为此探针水溶性较差，由此形成块状的沉淀（并且很难洗掉），在进行荧光成像时带来严重的干扰。

近日，济南大学的魏琴教授研究团队与山东大学的于晓强教授研究团队合作设计合成了一对荧光共振能量转移分子对（FRET Pairs）用于MMP比率荧光监测。FRET供体分子（FixD）通过将苄基氯基团连接到具有绿色荧光发光的荧光团来构建。FixD可以通过与线粒体蛋白的巯基连接并固定在线粒体中。设计具有绿色吸收和深红色荧光发射的FRET受体分子（LA），并且LA为线粒体膜电位依赖型线粒体探针。当MMP处于正常水平时，FixD和LA都靶向在线粒体上，用405 nm的激发波长来激发FixD时，FixD与LA之间发生FRET，所以监测不到绿色荧光，而可以检测到深红色（LA）的荧光发射。当MMP逐渐减少时，LA将从线粒体中逐渐脱落，而FixD仍然固定在线粒体中，分子之间的距离逐渐阻断了FixD与LA分子之间FRET的发生，进而可以检测到深红色荧光发射逐渐减少和绿色荧光发射逐渐增加。基于FRET机制，他们可通过两种荧光发射颜色的变化来监测MMP的动态变化。该研究为发展新型MMP荧光探针和对活体、组织和细胞中MMP的实时原位研究提供了新的思路。

这一成果近期发表在Anal. Chem. 上，济南大学为第一单位。