一个新的花粉萌发孔形成调控因子INP2

花粉是植物的雄性生殖细胞，是植物繁殖和进化的基础。花粉萌发孔的正常形态是花粉管萌发所必须的，帮助花粉水合，改变体积并萌发【1-5】。前期研究表明，植物特异性蛋白INP1在拟南芥、水稻和玉米等远缘物种中是一个关键的调控因子，INP1功能的丧失可以阻止花粉孔的形成，从而阻止了花粉管的萌发【6，7】。尽管INP1同源物在开花植物中发挥着类似的作用，但它们在序列上存在显著差异，且往往不能相互替代【8】，这表明INP1可能需要物种特异性的合作伙伴。

2021年6月28日，美国俄亥俄州立大学的研究人员在Nature Plants上在线发表了题为A species-specific functional module controls formation of pollen apertures的研究论文，报道了一个新的花粉萌发孔形成调控因子INP2，是INP1的物种特异性互作蛋白。两个蛋白以物种特异性的方式相互作用，当两种蛋白都表达时，它们可以在异源系统中恢复花粉萌发孔形成的表型，但当单独表达时，它们不能恢复花粉孔的形成。

首先，为了发现与花粉萌发孔形成有关的新基因，对经EMS诱变的拟南芥M2群体进行了正向遗传筛选。由于花粉形状的变化可以作为孔隙形成缺陷的替代指标，在解剖显微镜下对这些植物进行了异常花粉形状的筛选。筛选发现一个突变体产生的花粉看起来比野生型花粉圆得多，与inp1突变体的表型非常相似。共聚焦显微镜检查表明，与inp1一样，该突变体的花粉完全没有气孔(无气孔表型)，但具有正常的外壁。为了测试突变是INP1的等位基因还是干扰了另一个基因，将新的突变体与inp1-1缺失突变体杂交。在该杂交F1代中，所有花粉都有正常的花粉孔，表明该缺陷影响了INP1以外的基因。这一结果还表明，与inp1和其他先前发现的孔径突变体类似，新的突变体影响了一个具有孢子体功能的基因。由于与inp1突变体的相似性，我们将新基因命名为INP2（INAPERTURATE POLLEN2) 及其突变等位基因inp2-1。随后， 通过定位克隆表明AT1G15320编码INP2和0.7kb的上游区域足以驱动INP2的功能表达。然后，这个0.7kb启动子区域被用于所有随后转化到拟南芥的INP2构建。

进一步分析表明，INP2在蛋白质结构（包括植物特异性的DOG1结构域）、表达模式、进化分化趋势、突变表型和遗传相互作用等方面与INP1相似。蛋白互作分析表明，INP1和INP2可以直接互作。通过在烟草叶片细胞中表达INP1和INP2，并进行免疫共沉淀、双荧光分子互补(BIFC)和分裂荧光素酶检测，进一步验证了INP1和INP2在植物中相互作用的能力。

基于这些数据，作者推测INP2可能是INP1的物种特异性伙伴。作者用番茄(SLINP1和SLINP2)中的INP1和INP2的同源基因验证了这一观点，共表达SlINP1和SlINP2恢复拟南芥突变体的花粉孔形成。首先，作者发现番茄中的SLINP1和SLINP2与拟南芥的同源基因有大约45%的氨基酸同源性。使用Y2H和分裂荧光素酶测定，证实了SlINP1和SlINP2相互作用的能力。此外，在这两种检测中，番茄INP蛋白都与彼此特异地相互作用，但不能与拟南芥同源蛋白相互作用。其次，作者将SlINP2置于AtINP2启动子的控制下，并将AtINP2pr：SlINP2转化到拟南芥inp2-1突变体中。与先前SlINP1的研究类似，SlINP2未能恢复拟南芥inp2 突变体(12/12 T1植株)中的孔道，这表明INP2也表现出功能性的物种特异性。最后，在拟南芥中SlINP1和SlINP2共表达则可恢复拟南芥突变体的花粉孔形成。

番茄INP1和INP2的同源基因单独表达时在拟南芥突变体中不能发挥功能，但在共表达时可恢复花粉孔的形成

综上，该研究发现了一个新的花粉孔调控因子INP2，是INP1的物种特异性互作蛋白。两个蛋白以物种特异性的方式相互作用，当两种蛋白都表达时，它们可以在异源系统中恢复花粉孔形成的表型，但当单独表达时，它们不能恢复花粉孔的形成。INP蛋白形成了一个物种特异性的功能模块，这是植物花粉孔形成的基础。

参考文献：

1. Zhou, Y. & Dobritsa, A. A. Formation of aperture sites on the pollen surface as a model for development of distinct cellular domains. Plant Sci. 288, 110222 (2019).

2. Heslop-Harrison, J. An interpretation of the hydrodynamics of pollen. Am. J. Bot. 66, 737–743 (1979).

3. Katifori, E., Alben, S., Cerda, E., Nelson, D. R. & Dumais, J. Foldable structures and the natural design of pollen grains. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 7635–7639 (2010).

4. Vieira, A. M. & Feijó, J. A. Hydrogel control of water uptake by pectins during in vitro pollen hydration of Eucalyptus globulus. Am. J. Bot. 103, 437–451 (2016).

5. Zhang, X. et al. Rice pollen aperture formation is regulated by the interplay between OsINP1 and OsDAF1. Nat. Plants 6, 394–403 (2020).

6. Dobritsa, A. A. & Coerper, D. The novel plant protein INAPERTURATE POLLEN1 marks distinct cellular domains and controls formation of apertures in the Arabidopsis pollen exine. Plant Cell 24, 4452–4464 (2012).

7. Dobritsa, A. A., Kirkpatrick, A. B., Reeder, S. H., Li, P. & Owen, H. A. Pollen aperture factor INP1 acts late in aperture formation by excluding specific membrane domains from exine deposition. Plant Physiol. 176, 326–339 (2018).

8. Li, P. et al. INP1 involvement in pollen aperture formation is evolutionarily conserved and may require species-specific partners. J. Exp. Bot. 69, 983–996 (2018).