一个新的花粉萌发孔形成调控因子INP2

花粉是植物的雄性生殖细胞，是植物繁殖和进化的基础。花粉萌发孔的正常形态是花粉管萌发所必须的，帮助花粉水合，改变体积并萌发【1-5】。前期研究表明，植物特异性蛋白INP1在拟南芥、水稻和玉米等远缘物种中是一个关键的调控因子，INP1功能的丧失可以阻止花粉孔的形成，从而阻止了花粉管的萌发【6，7】。尽管INP1同源物在开花植物中发挥着类似的作用，但它们在序列上存在显著差异，且往往不能相互替代【8】，这表明INP1可能需要物种特异性的合作伙伴。

2021年6月28日，美国俄亥俄州立大学的研究人员在Nature Plants上在线发表了题为A species-specific functional module controls formation of pollen apertures的研究论文，报道了一个新的花粉萌发孔形成调控因子INP2，是INP1的物种特异性互作蛋白。两个蛋白以物种特异性的方式相互作用，当两种蛋白都表达时，它们可以在异源系统中恢复花粉萌发孔形成的表型，但当单独表达时，它们不能恢复花粉孔的形成。首先，为了发现与花粉萌发孔形成有关的新基因，对经EMS诱变的拟南芥M2群体进行了正向遗传筛选。由于花粉形状的变化可以作为孔隙形成缺陷的替代指标，在解剖显微镜下对这些植物进行了异常花粉形状的筛选。筛选发现一个突变体产生的花粉看起来比野生型花粉圆得多，与inp1突变体的表型非常相似。共聚焦显微镜检查表明，与inp1一样，该突变体的花粉完全没有气孔(无气孔表型)，但具有正常的外壁。为了测试突变是INP1的等位基因还是干扰了另一个基因，将新的突变体与inp1-1缺失突变体杂交。在该杂交F1代中，所有花粉都有正常的花粉孔，表明该缺陷影响了INP1以外的基因。这一结果还表明，与inp1和其他先前发现的孔径突变体类似，新的突变体影响了一个具有孢子体功能的基因。由于与inp1突变体的相似性，我们将新基因命名为INP2（INAPERTURATE POLLEN2) 及其突变等位基因inp2-1。随后， 通过定位克隆表明AT1G15320编码INP2和0.7kb的上游区域足以驱动INP2的功能表达。然后，这个0.7kb启动子区域被用于所有随后转化到拟南芥的INP2构建。

进一步分析表明，INP2在蛋白质结构（包括植物特异性的DOG1结构域）、表达模式、进化分化趋势、突变表型和遗传相互作用等方面与INP1相似。蛋白互作分析表明，INP1和INP2可以直接互作。通过在烟草叶片细胞中表达INP1和INP2，并进行免疫共沉淀、双荧光分子互补(BIFC)和分裂荧光素酶检测，进一步验证了INP1和INP2在植物中相互作用的能力。

基于这些数据，作者推测INP2可能是INP1的物种特异性伙伴。作者用番茄(SLINP1和SLINP2)中的INP1和INP2的同源基因验证了这一观点，共表达SlINP1和SlINP2恢复拟南芥突变体的花粉孔形成。首先，作者发现番茄中的SLINP1和SLINP2与拟南芥的同源基因有大约45%的氨基酸同源性。使用Y2H和分裂荧光素酶测定，证实了SlINP1和SlINP2相互作用的能力。此外，在这两种检测中，番茄INP蛋白都与彼此特异地相互作用，但不能与拟南芥同源蛋白相互作用。其次，作者将SlINP2置于AtINP2启动子的控制下，并将AtINP2pr：SlINP2转化到拟南芥inp2-1突变体中。与先前SlINP1的研究类似，SlINP2未能恢复拟南芥inp2 突变体(12/12 T1植株)中的孔道，这表明INP2也表现出功能性的物种特异性。最后，在拟南芥中SlINP1和SlINP2共表达则可恢复拟南芥突变体的花粉孔形成。

番茄INP1和INP2的同源基因单独表达时在拟南芥突变体中不能发挥功能，但在共表达时可恢复花粉孔的形成

综上，该研究发现了一个新的花粉孔调控因子INP2，是INP1的物种特异性互作蛋白。两个蛋白以物种特异性的方式相互作用，当两种蛋白都表达时，它们可以在异源系统中恢复花粉孔形成的表型，但当单独表达时，它们不能恢复花粉孔的形成。INP蛋白形成了一个物种特异性的功能模块，这是植物花粉孔形成的基础。