华中农大严顺平课题组揭示了ATR-WEE1激酶模块调控DNA复制胁迫响应的机制

来源：植物科学最前沿

2021年1月15日，Nucleic Acids Research 发表了以华中农业大学严顺平教授为通讯作者的题为The ATR-WEE1 kinase module inhibits the MAC complex to regulate replication stress response的研究论文。该论文系统地研究并揭示了在拟南芥中，ATR1-WEE1激酶模块通过抑制MAC复合体的方式来帮助植物克服DNA复制胁迫。

研究背景

1.DNA的损伤响应（DDR）对于维持基因组稳定性十分重要。DDR机制包括激活细胞周期检查点，DNA修复，转录的重编程以及细胞凋亡。DDR调控主要由两个进化上保守的激酶进行，包括ATM激酶和ATR激酶介导的信号通路。当形成单链DNA（ssDNA）损伤或者DNA复制滞留于复制叉形成阶段时，通常会激活ATR激酶模块介导的DDR。在动物和酵母中的研究已经表明ATR-WEE1激酶调控模块对于DNA损伤修复十分重要，而在植物中其重要性和作用机理还仍不清楚。

2.在动物和酵母中的研究发现ATR-WEE1激酶调控模块下游通过激活PRP19复合体（又被称为MAC复合体）来发挥作用。在拟南芥中，MAC复合体被报道参与到了RNA剪切和miRNA的合成过程中，而MAC复合体是否也参与到了DDR中呢？仍然未有报道。

3.尽管酵母或者动物中atr和wee1突变体导致胚胎致死，拟南芥中已经报道的atr和wee1突变体并没有十分严重的生长发育缺陷，暗示植物中的ATR-WEE1激酶模块的作用与其在酵母或者动物中已经被广泛研究的功能存在差异。前期研究表明，小分子化学试剂hydroxyurea(HU)可以通过中止DNA复制过程来引起的DDR。ATR-WEE1激酶模块的主要生理作用是抑制细胞周期蛋白依赖的激酶，而HU的施加会导致细胞周期蛋白依赖激酶的大量增加，因此在atr和wee1突变体中施加HU会引起根系变短的表型，暗示这两个突变体存在响应DNA复制胁迫的缺陷。然而它们是如何起作用的仍然未知。因此严顺平教授课题组基于这一表型，在atr突变体中构建了激活标签插入体系来进行遗传筛选可以回补atr单突变体对于HU超敏感表型的抑制子，从而更好地了解ATR-WEE1激酶调控模块在拟南芥中的工作机制。

主要研究结果

1. 通过建立高效的遗传筛选体系，作者成功鉴定到了一个特异性回补atr突变体对HU处理超敏感表型（而非其他类型的DNA损伤）的转基因株系soat2。随后通过基因克隆，T-DNA突变体（mcr1）验证以及基因回补实验，作者证明了是由于PRL1基因的功能缺失回补了atr突变体对HU处理超敏感的表型。PRL1蛋白是拟南芥中MAC复合体的重要组成成分，那么其它MAC复合体的重要组分是否也可以有相当的功能呢？作者通过杂交获得了atr cdc5双突变体，表型分析显示atr cdc5双突变体也表现出对HU的不敏感，表明在拟南芥中，MAC复合体的缺失可以抑制atr突变体对HU处理超敏感的表型。之前的遗传分析已经表明ATR激酶下游通过WEE1激酶进行传递，而且wee1单突也呈现出对HU处理超敏感的表型。作者通过杂交获得了wee1 cdc5以及wee1 mcr1 双突变体进行HU敏感性的表型实验分析表明这几个双突变对HU不敏感，这表明WEE1通过负调控CDC5以及PRL1来执行其功能。

2.随后，作者通过体外pull-down实验，免疫共沉淀实验以及Spilt luciferase实验证明WEE1与PRL1存在蛋白水平上的相互作用，进一步通过蛋白质截短的方式，作者探索了二者互作的关键区域，发现PRL1的N末端与WEE1的N末端互作，而PRL1的C末端介导了与其它蛋白的互作。通过体内磷酸化实验和质谱手段，作者发现WEE1可以在体内磷酸化PRL1蛋白第145的Ser，并且HU处理会使得磷酸化水平上升。

3.进一步通过半体内泛素化实验，作者发现PRL1蛋白会被Col-0的组织提取物泛素化，而在wee1突变体的组织提取物处理下其泛素化水平变化不大。进一步通过检测PRL1-GFP蛋白在不同遗传背景下的泛素化水平，作者发现WEE1的功能对于PRL1体内泛素化十分重要，而且PRL1蛋白的磷酸化水平也会影响其泛素水平。进一步的体内体外实验表明，PRL1蛋白泛素化后会被26S蛋白酶体途径快速降解。

4.作者进一步将多种磷酸化形式的PRL1-GFP蛋白表达在WEE1激酶区域缺失的突变体中，发现PRL1蛋白或者是PRL1蛋白去磷酸化形式的含量明显高于模拟磷酸化形式的PRL1蛋白，这表明WEE1通过磷酸化PRL1来促进其泛素化降解，这也与遗传分析的结果相一致。

5.那么作者发现的ATR-WEE1激酶模块抑制MAC复合体的机制有什么重要的生理意义呢？先前的研究表明MAC突变体中会出现RNA剪切的缺陷，RNA-seq的结果表明这些RNA剪切缺陷会导致许多重要的细胞周期相关基因CYCD1;1和CYCD3;1出现内含子滞留现象。因此MAC复合体的功能缺失很可能是通过影响了重要的细胞周期相关基因转录本的正常剪切，从而下调了HU引起的细胞周期蛋白依赖激酶大量增加，因此缓解了atr以及wee1对HU超敏感的表型。遗传上，在wee1 mcr1双重突变体中过表达CYCD1,1和CYCD1,3也会进一步导致双突变体对HU处理表现出敏感的表型，支持了作者的推论！

图1. 在复制胁迫下，PRL1调节细胞周期基因的选择性剪接。

（A）（B）在prl1prl2双突变体中细胞胞周期相关基因CYCD1；1和CYCD3；1出现内含子滞留现象；（C）在wee1mcr1双突变体或者mcr1突变体中可以出现高于wee1突变体中的细胞胞周期相关基因CYCD1；1和CYCD3；1出现内含子滞留现象（D）（E）在wee1mcr1双突变体中表达细胞胞周期相关基因CYCD1;1和CYCD3;1可以回补wee1 mcr1双突变体对HU处理不敏感的表型。

一图解文

图2. ATR-WEE1激酶模块的工作模型

作者提出了一个工作模型来说明ATR-WEE1激酶模块和MAC复合体如何调节复制应激反应。在正常情况下，含有PRL1的MAC复合体介导细胞周期基因CYCD1;1和CYCD3;1的剪接，促进细胞周期进展。在复制胁迫下，ATR被激活诱导WEE1，进一步磷酸化PRL1并促进其泛素化和降解。此时的MAC复合体丧失活性，细胞周期基因的剪接受到影响，导致细胞周期阻滞，使细胞有足够的时间来解决DNA复制胁迫。

研究意义

本论文研究结果揭示了ATR-WEE1激酶模块通过调控一个RNA剪切复合体来调控DNA复制胁迫的深入机制。研究工作详实，遗传证据十分充足，条理明晰，是十分杰出的工作。希望严顺平老师课题组能基于该遗传筛选体系鉴定到直接参与到细胞周期调控的下游基因，为我们揭示拟南芥中ATR-WEE1激酶模块全新的、重要的功能。

课题组介绍

华中农业大学王利利为第一作者，严顺平教授为通讯作者。严顺平教授2001年本科毕业于浙江师范大学，2006年在中国科学院上海植物生理生态所获得博士学位，随后在美国杜克大学进行博士后研究工作。2014年回国在华中农业大学生命科学学院组建实验室并加入2012年成立的拟南芥研究中心，担任教授、博士生导师。严顺平课题组多年来一直致力于植物抗病机理，植物DNA损伤修复机理以及植物激素信号转导的研究。以第一或通讯作者在Nature, Molecular Cell, Cell Host & Microbe, PNAS等多个著名期刊发表学术论文多篇。