磷酸化蛋白组学鉴定到AT-hook结构域的核定位蛋白，作用于植物免疫途径

来源：BioArt植物

细胞中信号传导的表现形式主要包括连续的磷酸化反应和激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，MAPK通路被激活后可以磷酸化下游底物的丝氨酸或苏氨酸位点，这一蛋白翻译后修饰活动可以调节蛋白活性、亚细胞定位及稳定性，发挥广泛的功能。而最显著的针对MAPKs的反应发生在染色质水平【1】。MAPKs的主要功能包括绑定转录因子、绑定染色质修饰和重组因子、直接绑定DNA分子调控转录及组蛋白修饰等。在植物中，MPK3/MPK4/MPK6因为其参与发育，生物和非生物胁迫的调节而被广泛研究【2】。前期研究发现MPK3/MPK4/MPK6在PTI免疫信号通路中分别特异性协同发挥功能【3】。众多的研究表明真核生物中招募MAPKs到染色质的现象广泛存在，但是植物中的研究还相对欠缺。

近日，沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学的研究人员在美国国家科学院院刊PNAS发表一篇题为Chromatin phosphoproteomics unravels a function for AT-hook motif nuclear localized protein AHL13 in PAMP-triggered immunity 的研究论文。该研究利用磷酸化蛋白组学的方法，鉴定到染色质相关的MAPK底物蛋白AHL13，并揭示了该蛋白特殊的结构及其在植物免疫中的重要作用。

研究人员首先用 flg22处理野生型及mpk3、mpk4、mpk6突变体植株，对每组样品的染色质蛋白分别进行磷酸化蛋白组学分析，鉴定到336个磷酸化多肽，其中包括234个磷酸化蛋白；通过对获取的磷酸化蛋白进行方差分析，发现许多MAPK的染色质靶标与免疫活动无关，同时观察到在MAPK突变体中磷酸化水平相对较高，但是flg22诱导的磷酸化事件没有影响靶标蛋白的丰度和稳定性；研究中为了鉴定与免疫相关的染色质磷酸化靶标，进一步分析flg22处理后的磷酸化水平变化情况，鉴定到43个磷酸化多肽包括38个蛋白，其中有10个蛋白经过flg22处理后被重新磷酸化，以ARP9为例，被发现该蛋白的SP（丝氨酸和苏氨酸）位点特异性被MPK4靶定；因为MAPKs跟底物相互作用的强度受MAPK对接位点的影响，本研究还分析了磷酸化蛋白的对接位点情况；为了理解磷酸化蛋白在基因调节中的作用，对56个免疫相关磷酸化蛋白进行基因本体丰度归类，发现其中46个蛋白参与了染色体架构，RNA代谢，基因表达调控、转录调控、胁迫反馈等其他生物学活动，通过STRING进行蛋白互作网络分析揭示了MPK3/MPK4/MPK6在RNA代谢剪切及染色体架构中的相似功能，研究人员还生成了56个磷酸化多肽的磷酸化水平变化图谱，发现MAPKs可能调节激活磷酸化酶或相关蛋白的合成及降解等活动。

基于AHL13的S109和S376位点被磷酸化的现象，作者选择AHL13进行后续功能分析，AHL13的N端含有一个AT-hook结构域；BiFC和Pull-Down互作实验显示，AHL13特异性和MPK6而非MPK3/MPK4互作；为了理解AHL13参与PTI信号反应的过程，通过对免疫相关活动的测定，包括ROS的产生，基础防卫基因的表达，以及三型分泌系统缺陷病原细菌的致病性等，说明了AHL13正调控植物对病原细菌的抗性；进一步转录组分析，发现AHL13负调控茉莉酸（JA）水平而不影响水杨酸（SA）水平，并鉴定到JA信号通路的相关基因表达被AHL13影响，ahl13的突变体可以提高对灰霉菌的抗性；最后，研究人员通过构建去磷酸化及模拟磷酸化转基因株系，分析相应蛋白的亚细胞定位、稳定性和结构基础，证明AHL13的两个磷酸化位点对于其蛋白稳定性至关重要。

综上所述，本研究综合运用组学大数据分析，相应基因生物学研究、蛋白结构分析等方法，深入细致的分析了染色质相关的MAPK磷酸化底物情况，坚定了拥有AT-hook结构域的DNA绑定蛋白AHL13，功能分析揭示了AHL13磷酸化位点对于其蛋白稳定以及参与植物免疫活动的重要功能。该研究为磷酸化染色质相关靶标的鉴定和功能分析提供了大量的数据和研究基础，将推动免疫学研究中与染色质架构，转录调节及RNA活动等相关的研究进程。

参考文献：

【1】A. M. Klein, E. Zaganjor, M. H. Cobb, Chromatin-tethered MAPKs. Curr. Opin. Cell Biol. 25, 272–277 (2013)

【2】G. Komis, O. Samajová, M. Ove ˇ cka, J. ˇ Samaj, Cell and developmental biology of plant ˇmitogen-activated protein kinases. Annu. Rev. Plant Biol. 69, 237–265 (2018).

【3】N. Frei dit Frey et al., Functional analysis of Arabidopsis immune-related MAPKs uncovers a role for MPK3 as negative regulator of inducible defences. Genome Biol. 15, R87 (2014).