合成生物学研究进展：在烟草中表达登革热病毒蛋白，实现了病毒样颗粒体内组装

来源：iPlants

近日，英国约翰英纳斯中心生物化学部门的HadrienPeyret教授团队在Plant Biotechnology Journal杂志上在线发表了一篇题为“Plant‐made dengue virus‐like particles produced by co‐expression of structural and non‐structural proteins induce a humoral immune response in mice”的文章。文章在烟草中表达了登革热病毒结构蛋白和截短形式的非结构蛋白，实现了病毒样颗粒在植物中的组装，并成功引发了小鼠的免疫反应。

登革热病毒（DENV）是属于黄病毒科的一种致病性病毒，该病毒通过伊蚊传播，每年会造成3.9亿人感染，感染后可导致隐性感染、登革热出血和登革热休克综合征等。该病毒基因组由一条正义RNA的单链组成，该RNA编码一种包含三个结构蛋白（SP）和七个非结构蛋白（NSP）的多蛋白。SP包括衣壳（C），前体膜（prM）和信封（E）蛋白。目前世界上唯一获得批准的登革热疫苗Dengvaxia，对于年龄较小的血清阴性接种者而言存在抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement，ADE）现象，其安全性存在争议。为了避免触发ADE，对疫苗的生产策略进行了改进，其中包括开发DNA疫苗，减毒活DENV疫苗，DENV病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）疫苗和重组亚单位疫苗。其中，VLP在安全性和效率方面优势更明显，并且相较于在哺乳动物细胞、昆虫细胞和赤毕酵母表达系统中表达DENV prM-E来产生具有免疫抗原性的DENV VLP，植物表达系统在安全性、成本和翻译后修饰上更有优势。

文章中采用了两种策略在本氏烟草中表达DENV VLPs，一是表达prM-E载体（denv1-prM-E）同时共表达整个结构蛋白（denv1-sp）和NS5截短的非结构蛋白（denv1-nsp）；二是对DENV-E进行修饰，包括在E蛋白融合环结构的第108位进行点突变将丙氨酸变为苯丙氨酸（denv1-sp-f108a）以及同时进行点突变和替代（将DENV1-E的stem/anchor区域替换为日本脑炎病毒）（denv1-sp-f108a-jev）。

将本氏烟草用带有不同载体的农杆菌进行侵染，并在接种后6天收获。为了检测DENV蛋白是否可以在植物中表达，并释放到总可溶性蛋白（TSP）组分中，通过离心将不溶部分和可溶蛋白分开，进行Western blot检测prM和E是否存在。结果表明DENV1结构蛋白可以在植物中成功表达，并且NSP的存在会影响SP的产生。为了确定denv1-prM-E的表达以及denv1-nsp与denv1-sp或denv1-sp-f108a的共表达是否导致VLPs的形成，采用了三步超速离心纯化方案（浅蔗糖梯度，甘油梯度，长蔗糖梯度）进行纯化，并用透射电子显微镜（TEM）分析纯化后的蛋白，结果显示denv1-sp和denv1-nsp共表达后可以完成VLPs的形成和组装。最后在6-9周龄的小鼠体内接种纯化的DENV1 VLPs，进行抗原鉴定来确定纯化的蛋白是否具有免疫活性，结果显示DENV1 VLPs可以有效激活小鼠中有效的B细胞应答激活。