小型Cascade–Cas3系统在细菌中实现基因组大片段精准敲除

来源：BioArt

CRISPR-Cas系统是原核生物的“获得性免疫系统”，借此可以抵抗噬菌体为代表的“入侵者”。总体而言，CRISPR-Cas系统可分为两大类，I型系统需要多个Cas蛋白形成功能性复合物发挥作用；II型系统通常只依赖于单一的Cas蛋白。考虑到系统的便捷性，II型系统更受研究者关注，也是目前基因编辑的主力工具。不过，I型系统亦有其独特之处：其在原核生物中广泛存在，因此或可直接调用内源性的I型系统用于原始宿主的基因编辑；此外，其解旋-核酸酶Cas3经crRNA定位后，可沿基因组移动并持续降解邻近的DNA，而II型Cas蛋白则缺乏这种能力，这意味着I型系统在基因组大片段敲除方面更具潜力。近来多篇文章在人源细胞中证实，I型系统可被改造用于基因编辑（详见BioArt报道：Molecular Cell | 张燕/可爱龙合作组利用I型CRISPR-Cas系统实现大片段基因敲除 ）【1-3】和转录调控（详见BioArt报道：Nat Comm | 松阳洲组成功开发基于type I-F CRISPR-Cas系统的高效转录激活工具 ）【4-6】，证实了其用于基因编辑的可行性。不过目前I型CRISPR-Cas系统在原核生物中的应用依然有限，且缺乏系统性的评估和优化。

2020年10月19日，来自加州大学旧金山分校（UCSF）微生物与免疫学系的Joseph Bondy-Denomy实验室在Nature Methods发表题为A compact Cascade–Cas3 system for targeted genome engineering的论文。文章对绿脓杆菌(p.aeruginosa)来源的I-C型CRISPR系统PaeCas3c进行改造，并在多种原核生物中对改造后的PaeCas3c的基因编辑能力进行验证。研究发现，PaeCas3c系统可快速高效的实现基因组的大片段精准敲除和基因组最小化研究，为基因组级别的敲除研究提供了有力的工具。

PaeCas3c属于小型的I型CRISPR系统，只需四种Cas蛋白便可形成功能性复合物，而其它I型系统如I-E型系统则需要六种蛋白。为探究PaeCas3c的功能，研究者利用早先构建的携诱导型PaeCas3c系统的绿脓杆菌PAO1菌株开展研究。非诱导条件下，crRNA表达对绿脓杆菌本身并无明显的毒性作用。随后在诱导条件下，研究者导入特异性crRNA，靶向绿脓菌素（绿脓杆菌呈现绿色的关键）生成的关键基因phzM，发现很高比例的绿脓杆菌克隆呈黄色。测序显示，这类黄色绿脓杆菌phzM基因周围有20-60kb的大片段缺失，且靶位点位于缺失的大片段内部。这一结果表明，PaeCas3c系统能在靶位点附近双向诱导基因组大片段缺失。

随后的研究发现，原始版本的crRNA表达载体中的直接重复序列易发生重组，这对PaeCas3c系统介导的基因编辑有严重干扰。而后研究者对此进行突变改造，改造后的crRNA表达载体效果提升明显，其介导的基因编辑效率可达94-100%。

之后，研究者在绿脓杆菌中对PaeCas3c系统与Cas9系统介导的基因编辑效果进行了对比，结果发现Cas9系统多介导基因组小片段缺失，且编辑效率偏低；而PaeCas3c则可高效介导基因组大片段缺失，缺失片段的平均长度可达26.6-48.2kb。考虑到Cas3持续降解单链DNA的能力，研究者还对其促进同源重组修复的效果进行了检测。结果显示，无论是249kb大片段敲除后的同源重组修复，亦或是0.17kb小片段敲除后的同源重组修复，PaeCas3c都有较高的效率，且明显优于Cas9系统。之后，研究者还在绿脓杆菌中证实，PaeCas3c系统在基因组最小化研究中也有明显的优势。

研究者还设计出可同时表达PaeCas3c系统所有功能元件的单一载体，并在大肠杆菌、丁香假单胞菌番茄致病变种以及克氏肺炎杆菌中验证了其基因组大片段敲除的效果。研究结果显示，PaeCas3c系统在以上三种原核生物中均能实现高效的基因组大片段敲除。

研究者还证实，在最早发现PaeCas3c系统的原始菌株PaLML1中，特异性crRNA的导入同样可诱导基因组靶位点的大片段缺失以及同源重组修复介导的精准编辑。研究还发现，内源性的I-F型CRISPR-Cas系统也可被改造用于原始菌株基因组靶位点的大片段敲除及精准编辑。此外，研究还指出，由于抗CRISPR蛋白（acr）的存在，内源性I型CRISPR-Cas系统的编辑效率会受到干扰，而这可以通过表达抗CRISPR蛋白的负向调控因子（抗抗CRISPR蛋白）加以改善。

总体而言，本研究通过改造优化小型Cascade-Cas3系统PaeCas3c，在细菌中实现了快速高效的基因组大片段敲除及精准编辑，并在细菌基因组最小化研究中有明显优势。此外， Cascade-Cas3系统能明显促进大片段敲除后的同源重组修复过程，这意味着该系统在基因组大片段的精准编辑及功能研究中极具潜力，并值得更进一步的探索。

参考文献

1. Dolan, A. E. et al. Introducing a spectrum of long-range genomic deletions in human embryonic stem cells using type I CRISPR-Cas. Mol. Cell 74, 936–950.e5 (2019).

2. Morisaka, H. et al. CRISPR–Cas3 induces broad and unidirectional genome editing in human cells. Nat. Commun. 10, 5302 (2019).

3. Cameron, P. et al. Harnessing type I CRISPR–Cas systems for genome engineering in human cells. Nat. Biotechnol. 37, 1471–1477 (2019).

4. Pickar-Oliver, A. et al. Targeted transcriptional modulation with type I CRISPR–Cas systems in human cells. Nat. Biotechnol. 37, 1493–1501 (2019).

5. Chen, Y. et al. Repurposing type I–F CRISPR–Cas system as a transcriptional activation tool in human cells. Nat. Commun. 11, 3136 (2020).

6. Young, J. K. et al. The repurposing of type I-E CRISPR-Cascade for gene activation in plants. Commun. Biol. 2, 383 (2019)