开发番茄果实特异性基因编辑助力植物必需基因的功能研究

来源：植物科学最前沿CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术已被广泛运用于多个植物物种基因功能和表达的修饰，该技术介导的基因修饰通常是瞬时或稳定遗传的基因改变。虽然该技术在许多应用中极为有用，但一些必需基因的改变或缺失可能使植物致死，也可能通过多效性效应影响植物多个发育或反应过程，从而导致无法对特定组织或发育阶段中的基因功能进行评估。最近，时空调控的CRISPR-Cas9技术在拟南芥中被报道，该技术为预计10％的必需基因的CRISPR-Cas9应用打开了另一扇门。

近日，康奈尔大学博伊斯·汤普森植物研究所的Ari Feder等人在Horticulture Research发表了题为Tomato fruit as a model for tissue-specific gene silencing in crop plants的研究论文，开发了一种基于以PPC2基因的启动子启动Cas9的表达，通过设计SgRNA靶向外源插入GFP基因和內源SlEZ2基因进行测试，证明该编辑系统可以在番茄中实现果实特异性编辑。
该研究通过载体改造将原来编辑载体中启动Cas9的组成型启动子35S换成PPC2启动子；引入35S+GFP元件作为转基因整合的标记，有利于后续组织特异性基因敲除的观察。初始评价中将对照载体命名为cGFP(没有加靶向GFP的gRNA)，实验载体命名为gGFP(加靶向GFP的gRNA)。如图1所示，gGFP转基因家系的果实在结果期绿色荧光消失，而种子中保持着荧光，该观察结果与PPC2基因在种子中表达量较低的结果一致。进一步研究发现该转基因家系可以稳定遗传给后代，但T1代中大部分幼苗遗传非编辑的GPF序列，这与在种子和幼苗中PPC2介导的Cas9较低表达量相关。通过在T0代和T1代中利用GFP基因作为测试系统，初步确认了果实特异性编辑在番茄中的可行性。研究者进一步设计sgRNA靶向SLEZ2基因，该基因参与多个发育过程，前人研究表明SLEZ2RNAi可以产生一系列突变表型。比较SLEZ2基因果实特异性沉默单株表型和前人报道的的SLEZ2RNAi转基因系表型，发现SLEZ2基因果实特异性沉默不仅得到了以前的结果，还能够影响后期果实发育。
以上结论表明该研究中开发的果实基因组编辑平台是一种有效的工具，可以避免由于基因多效性影响果实发育中的基因功能研究。

Figure1. Fluorescence and sequencing of genome-integrated GFP sequence in control(untransformed) and cGFP-i or gGFP-i transgenicplants