Nat Chem Bio：结合工程细菌与刺激灵敏性水凝胶实现生物智造

来源：BioArt

现阶段的蛋白生产工艺依赖于完善且昂贵的基础建设及精密设备。以大肠杆菌作为模式生物为例：细菌首先在发酵罐内发酵，之后通过收获和破碎（物理方法或者化学方法），释放细菌内部表达的蛋白；得到的混合物通过大型离心机离心或者过滤方法分离上清和细胞碎片，上清在收集之后进行进一步的纯化。在蛋白生产流程中，每一步都有大型的精密仪器参与。为避免交叉感染，一条管线通常只大规模生产一种蛋白。发酵是蛋白生产的上游环节，其他步骤都被归为下游处理（downstream processing）。在整个蛋白生产工艺中，下游处理占据了整个生产成本的75%－85%左右，也是生产过程中的关键环节。

虽然现代的蛋白生产已具备成熟的工艺流程，但是其生产模式严重缺乏机动性与灵活性。一方面，现有的工艺流程，尤其是下游处理的每一步都需要良好的基础建设及大型的精密仪器设备，难以满足落后偏远地区、紧急状态（灾害、交通链断裂等）、以及战地情况的蛋白试剂需求。另一方面，精准医疗的迅猛发展提出针对患者个体的小剂量、定制化、快速高效的蛋白生产。这些要求都对传统蛋白生产的模式提出了巨大挑战。

近20年来，研究者们针对传统蛋白生产的局限，研发了“一次性生产工艺（single-use technology）”来提高蛋白生产的机动性与灵活性。此类研究的核心是将蛋白生产中的不锈钢发酵罐或者管线替换成一次性使用的塑料或其他价格低廉的产品,或者直接缩小发酵容器使得蛋白生产便携化。虽然一定程度上可以改进生产成本与灵活性的问题，但是，“一次性生产工艺”在蛋白生产技术上并没有进行本质的创新。并且，目前的“一次性生产工艺”改良主要停留在对上游生产（发酵环节）的部件替换，而对下游处理环节：包含裂解、分离与纯化等几个关键步骤几乎没有渗透。而在整个蛋白生产工艺中，下游处理是蛋白生产成本产生的主要来源，也是制约蛋白生产机动性与灵活性的关键环节。

2019年9月16日，美国杜克大学游凌冲团队（第一作者为戴卓君博士，现任职于中国科学院深圳先进技术研究院）在Nature Chemical Biology杂志上发表文章Versatile biomanufacturing through stimulus-responsive cell–material feedback，建立一种可双向感应的蛋白生产平台，解决了蛋白生产中灵活性与机动性的问题。

基于现有的问题，研究人员提出了一个全新的设计：通过建立工程细菌与智能材料的双向响应，实现集成（integrated）的蛋白表达、释放、分离与运输。设计思路如图1所示，该工作中利用智能微胶囊包裹植入基因线路的大肠杆菌（MSB, Microbial Swarmbot）。一方面，细菌在胶囊中生长达到一定密度后，感知到胶囊的物理空间局限从而自主裂解，释放出体内表达的蛋白（来自工程细菌的针对材料的响应）；另一方面，细菌的生长改变了环境的pH, 离子强度等，促使智能微胶囊实现从溶涨到收缩的转换（来自智能胶囊的针对细菌的响应）。胶囊尺寸的变化带来的挤出效应将细菌释放出的目标蛋白高效的从胶囊内部输送到外部，而胶囊的三维网络交联结构限制了活细菌的运动，有效的起到分离作用。系统通过培养基的置换重置到起始状态，此时胶囊恢复溶涨，细菌从低密度开始生长，从而实现持续的蛋白生产。而平台的下游可接入各种模块，比如纯化、筛选、以及多蛋白系统组装等。

图1:结合合成生物学与材料工程实现蛋白表达、释放、分离与运输的一体化。工程细菌与智能材料的双向响应实现生物智造：工程细菌在胶囊中生长达到一定密度后，感知到胶囊的物理空间局限（群体感应）从而自主裂解，释放出体内表达的蛋白；细菌的生长改变了环境的pH, 离子强度等，促使智能微胶囊实现从溶涨到收缩的转换，挤出释放的目标蛋白。系统通过培养基的置换重置到起始状态。

研究人员需要两个基础的部件来搭建平台，分别是编译大肠杆菌可以在高密度时自主裂解的基因回路，以及对细菌生长有响应的水凝胶胶囊。

首先，研究人员利用实验室之前构建的ePop回路对细菌进行编译。在ePop回路的设计中，细菌表达一种来源于噬菌体phix174的E蛋白，E蛋白会阻碍大肠杆菌细胞壁的合成，当细菌密度达到一定程度时，积累的毒素就会导致细菌裂解。另一方面，利用带正电的壳聚糖高分子作为胶囊制作的材料，利用壳聚糖与三聚磷酸分子的正负电荷相互作用构建交联体系并制作尺寸约为400微米的智能微胶囊（直径）。壳聚糖的分子链上大量的氨基（pKa 约为6.2-6.8）使其具有pH及离子强度灵敏性。例如，当pH 低于pKa时，氨基质子化导致胶囊带正电，在正电荷之间的相互排斥作用驱使下胶囊溶胀；当pH 高于pKa时，氨基去质子化导致胶囊中性从而塌缩。细菌的生长会改变培养基中的环境，从而导致智能微胶囊尺寸的变化。在实际培养中，无论是M9还是LB中，细菌的生长都促使胶囊产生从溶涨到收缩的转变。而胶囊收缩产生的挤出效应会增加产物从胶囊内运输到胶囊外的效率。

视频1：可自主裂解的工程细菌

视频2：细菌生长促使胶囊从溶胀到收缩的转化

值得一提的是，胶囊的隔离机制削弱了不同胶囊里菌群的相互作用。这种隔离机制可在控制合成功能菌群的组分中具有重要的作用。利用合成功能菌群可以快速方便的制备多蛋白系统。然而迄今为止，如何控制蛋白组分的比例仍是一个巨大的挑战。菌群内部不同细菌复杂的相互作用，使得在共培养过程中菌群的组成会发生难以预测的变化。例如，代谢负担轻的细菌会快速生长并迅速消耗营养成为菌群中的主导者，而代谢负担重的细菌由于生长缓慢导致最终的灭绝。而胶囊的半透膜性质的物理屏障削弱了细菌间复杂的相互作用，微凝胶的搭载能力决定了细菌密度的上限，使得最终产物中蛋白组分可以通过对应的细菌微凝胶数量精确调控。

为进一步展示该平台优势以及潜在的应用场景，研究人员尝试在平台下游接入多种不同应用。包括利用微流控系统展示蛋白（β-内酰胺酶）的表征；在下游接入不同的纯化模块，实现单种、或多种蛋白（包括多种药物制剂蛋白）的一体式纯化；检测两种蛋白的偶联反应（利用FRET效应）；通过物理隔离的菌群分工合作得到更高性能的酶产物;以及重构体外的脂肪酸合成通路合成脂肪酸等。实验数据表明MSB可持续工作约7天；在合适的保存条件下，MSB可保存相当长的时间不影响其效果；只需要加入培养基，重悬MSB，培养，就可以直接通过下游接入纯化模块得到纯化后的蛋白试剂。

到目前为止，研究者们研发的包含材料与生物（生物大分子或者生物体）的复合系统（例如搭载蛋白药物的微凝胶系统等）中，通常只存在单向的感应。在该设计中，一方面，工程细菌可以感知材料的物理空间局限，产生密度为响应的裂解从而释放蛋白；另一方面，材料可以感知工程细菌的生长，产生收缩增加运输的效率。本项目通过建立这种双向感应实现一个精确设计的、整合的平台功能。

与传统的蛋白生产以及一次性工艺相比，该工作中的研究者试图采用一种全新的思路，集成蛋白表达下游处理中的关键步骤以解决蛋白生产中灵活性与机动性的问题。与无细胞系统相比，该设计引入了更高生产效率的工程细菌并增加了产物的分离功能；与分泌性表达相比，该系统不只局限于那些可被分泌表达的蛋白，极大的增加了平台的普适性。

根据这一平台设计，裂解模块和分离模块的每一个部件都是可替换以及可优化的。例如裂解模块的基因线路可以被替换成其他编译细胞裂解的基因线路；目标的蛋白序列可以替换成其他任意可表达的蛋白；分离模块的高分子材料可以根据需求替换成负电荷高分子，并通过调整孔径尺寸、表面修饰等优化分离性能；下游可以接入多种纯化模块。同时平台的生产规模可以通过调整细菌智能微胶囊的数量及反应容器规格等进行调节，以满足不同规模的蛋白生产需求。

中科院深先院合成生物学研究所 戴卓君课题组招聘博士后（课题组网站http://isynbio.siat.ac.cn/ZDlab/）。

课题组结合合成生物学与高分子物理化学工具实现绿色制造及研发活体功能材料。前期成果以第一作者在Nature Chemical Biology, Biomaterials和Macromolecules等重要学术期刊发表。欢迎有合成生物学、高分子合成、蛋白工程研究背景的博士后加入！简历可直接发送zj.dai@siat.ac.cn

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41589-019-0357-8