Cell亮点丨cGAS促进有丝分裂异常细胞死亡，助力紫杉烷类药物化疗的效果

来源：BioArt

在体细胞中，外源的双链DNA（如病毒）和细胞自身的双链DNA（如受损的线粒体DNA、微核DNA、反转录转座子等）会被cGAS（cyclic GMP-AMP synthase，受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶）识别【1】。cGAS和DNA结合后会催化第二信使环鸟苷酸-腺苷酸（cyclic GMP-AMP dinucleotide， cGAMP）的产生【1,2】，产生的环鸟苷酸-腺苷酸会结合和激活干扰素刺激蛋白STING，STING蛋白会招募丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（TBK1），从而来激活IRF3，最终导致I型干扰素和免疫因子的产生。cGAS通路还可以通过转录激活凋亡调节因子，以及IRF3的转录无关作用，促进细胞凋亡。（图1，左）

图1 cGAS 信号通路简图

细胞自身染色体DNA位于细胞核内，由核膜将其与细胞质的cGAS隔离，因此cGAS对核DNA访问受限。而当细胞进行有丝分裂时，核膜这一动态屏障会发生变化，结果可能导致cGAS募集至染色体上触发异常的炎症转录反应【3】。最近的研究表明，核定位cGAS对自身DNA的识别活性低于对外源性胞质DNA的200倍，尽管核定位cGAS活性明显减弱，但其仍能诱导树突状细胞的先天免疫激活【3】。

紫杉烷类药物如紫杉醇 Taxol（paclitaxel）可稳定微管并干扰有丝分裂，因此常用于癌症化疗。然而人们对微管稳定从而产生抗癌效果的原因不得而知。紫杉醇处理后的细胞在有丝分裂过程中会停滞在纺锤体组装检查点【4】，随即走向两条不同的命运之路，因染色体无法正常分离而退出有丝分裂，或是停滞在有丝分裂时期发生细胞凋亡。维持cyclin B高于阈值水平会影响染色体分离的时机，而细胞凋亡时机的选择则取决于细胞内“死亡信号”积累到达阈值水平的速度。有丝分裂停滞时发生的细胞凋亡往往是通过线粒体外膜渗透（ mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）来实现的。然而，对细胞死亡信号积累和阈值的动力学研究却知之甚少。

cGAS在应答外源致病性DNA引起的先天免疫反应中发挥至关重要的作用，但是，当有丝分裂核膜破裂将cGAS暴露于自体染色体时又会造成怎样的后果呢？（图1，右）

2019年6月20日，来自美国洛克菲勒大学的Hironori Funabiki和Christian Zierhut教授团队合作在Cell杂志上发表了题为 The Cytoplasmic DNA Sensor cGAS Promotes Mitotic Cell Death 的研究长文，揭示了核小体对cGAS比DNA更具亲和力，并且会抑制DNA诱导的cGAMP合成。当有丝分裂过程发生停滞时，依赖于cGAS的IRF3磷酸化会缓慢累积并通过非转录依赖的机制促进有丝分裂细胞凋亡，通过小鼠异种移植试验和TCGA数据库分析表明了cGAS在紫杉醇化疗中发挥的促进作用，为肿瘤化疗提供了理论支持。

早在2017年，就有研究报道染色质可以与cGAS相互作用，但这一生物现象背后的功能含意尚不明确【5】。本研究中，研究人员首先利用35S标记cGAS体外验证cGAS与染色质组分的结合情况，发现cGAS在体外与核小体的结合要明显强于裸DNA。利用纯化组分进行凝胶位移定量分析，进一步证实重组的cGAS与单核小体具有较裸DNA更高的亲和力。突变cGAS上的DNA结合残基（KRKK mutant）大大降低了cGAS对裸DNA的亲和力,但对其结合核小体的能力无明显影响，这表明cGAS与DNA和核小体结合的机制是不同的。

进一步体外结合实验发现cGAS结合纯化的H2A-H2B异质二聚体，但是改变H2A-H2B的酸性表面结构（ap*A, ap*KR,通常作为核小体结合蛋白的靶点）会影响其与丙氨酸或赖氨酸和精氨酸之间的相互作用。核小体可以通过cGAS刺激cGAMP的合成，但与结合DNA的cGAS相比，与核小体结合的cGAS其表观催化速率降低了3倍。当在一定数量的裸DNA和cGAS混合体系种加入越来越多的核小体时，核小体会竞争性地抑制裸DNA激活cGAS的能力。

与cGAS和核小体的相互作用一致，cGAS会被募集至有丝分裂的染色体上。HeLa细胞中外源表达GFP-cGAS的活细胞实时成像显示，当核膜破裂后，cGAS会立即与染色体结合。为了确定染色体结合的cGAS是否能在有丝分裂过程中激活下游信号，研究人员选择IRF3-Ser396位点（广泛使用的cGAS活化指标）对其磷酸化进行监测。通过外源表达GFP-IRF3，研究人员发现在紫杉醇（Taxol）和nocodazole（诺克达唑）诱导的有丝分裂停滞过程中，GFP-IRF3 Ser396位的磷酸化以cGAS依赖的方式缓慢积累。免疫沉淀法富集内源性IRF3后，内源性IRF3的Ser396，Ser386位点在有丝分裂时也发生了cGAS依赖的磷酸化。

对有丝分裂停滞不同的时间点IRF3的磷酸化水平进行分析，研究人员认为在正常有丝分裂过程中，与染色体结合的cGAS可能不会产生任何后果，因为有丝分裂通常在30分钟内完成，而cGAS信号的激活传递则需要数个小时才能发生。敲减cGAS既不影响细胞存活能力，也不影响有丝分裂的持续时间。

然而，当细胞有丝分裂发生停滞时，即使是较低的cGAS活性也可能在功能上产生一定的后果。cGAS蛋白水平在不同的细胞系之间有很大的差异，由于cGAS及其下游效应物STING和IRF3在之前报道了可以促进细胞死亡，研究人员检测了cGAS是否会影响细胞在染色体分离滑脱和死亡之间命运的抉择。通过实时成像追踪单个有丝分裂细胞，监测单个细胞的死亡率和有丝分裂的周期。

因为乳腺癌的治疗经常用到紫杉烷类药物，研究人员首先对7株乳腺癌细胞系进行分析，其中4株表达cGAS，3株不表达。在4株表达cGAS的细胞株中有3株细胞（HCC1143, MDA-MB-231, BT549）表现出来有丝分裂停滞时IRF3磷酸化的激活，当对细胞进行10nM Taxol（与临床化疗浓度相似）处理时，上述3株阳性细胞系容易在有丝分裂中死亡，而3株表达阴性的细胞株则最终进入间期。当Taxol浓度增加到500 nM时，cGAS阴性细胞株和MDA-MB-231细胞的阻滞时间普遍延长，增加了有丝分裂细胞死亡的机会。然而，阴性细胞株CAL51和T47D仍然更容易发生染色体分离滑脱。阴性细胞株中有丝分裂细胞死亡的趋势减少并不是由更快的滑脱引起的，有丝分裂活力在没有Taxol处理的情况下各细胞间无明显差异。MDA-MB-231中的cGAS敲除降低了高浓度Taxol治疗后的有丝分裂细胞死亡。总之，在许多细胞系中，cGAS的表达与细胞对紫杉醇诱导的有丝分裂停滞过程中死亡的易感性有关。

紧接着，研究人员进行了小鼠异种移植肿瘤模型实验。实验结果表明紫杉醇对WT肿瘤的生长有延迟作用，但对cGAS缺失肿瘤的生长无明显影响。此外，紫杉醇治疗的WT肿瘤表现出了大面积的凋亡情况，表明cGAS促进小鼠异种移植肿瘤模型对紫杉醇的反应。

最后，利用TCGA数据库，研究人员进行了cGAS通路与乳腺癌患者对紫杉烷化疗反应之间的相关性分析，根据肿瘤内cGAS、STING和IRF3的RNA水平以及是否使用紫杉烷类药物治疗对患者进行分层。分析结果表明cGAS信号通过STING传递至IRF3对紫杉醇治疗的乳腺癌患者具有重要的意义，cGAS通路或有助于紫杉烷类药物化疗的效果。

总的来说，本研究结果表明在正常细胞有丝分裂过程中，cGAS的激活受到核小体的抑制。然而，在长时间的有丝分裂停滞过程中，低水平的依赖于cGAS的IRF3磷酸化会缓慢累积，缓慢积累的磷酸化的IRF3通过减缓Bcl-xL依赖的抑制线粒体外膜通透性作用刺激细胞凋亡，并且与转录诱导无关。cGAS和IRF3在肿瘤细胞中的表达使小鼠异种移植模型对抗有丝分裂药物紫杉醇产生应答，进一步研究cGAS在有丝分裂缺陷反应中的功能有助于我们了解肿瘤的发展和化疗反应，为临床治疗提供有效的帮助。(下图)

图2 cGAS促进有丝分裂异常细胞死亡

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.035

制版人：珂

参考文献

1. Chen, Q., Sun, L., and Chen, Z.J. (2016). Regulation and function of the cGAS-STING pathway of cytosolic DNA sensing. Nat. Immunol. 17, 1142–1149.

2. Ablasser, A., Goldeck, M., Cavlar, T., Deimling, T., Witte, G., Rohl, I., Hopfner, K.-P., Ludwig, J., and Hornung, V. (2013). cGAS produces a 2’-5’-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature 498, 380–384.

3. Gentili, M., Lahaye, X., Nadalin, F., Nader, G.P.F., Puig Lombardi, E., Herve, S., De Silva, N.S., Rookhuizen, D.C., Zueva, E., Goudot, C., et al. (2019). The N-Terminal Domain of cGAS Determines Preferential Association with Centromeric DNA and Innate Immune Activation in the Nucleus. Cell Rep. 26, 2377–2393.

4. London, N., and Biggins, S. (2014). Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 736–747.

5. Mackenzie, K.J., Carroll, P., Martin, C.-A., Murina, O., Fluteau, A., Simpson, D.J., Olova, N., Sutcliffe, H., Rainger, J.K., Leitch, A., et al. (2017). cGAS surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature 548, 461–465.