Cell | 高通量筛选抑制CRISPR-Cas9的小分子药物

来源：BioArt

许多基因工程技术的实施都需要依赖准确地对CRISPR-Cas9系统进行有效的控制从而保证基因编辑的准确有效。其中，来源于细菌的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)是一种可编辑的RNA引导的DNA核酸内切酶，易引发基因组的改变。机制上，SpCas9和向导RNA(gRNA)组成的复合体通过PAM序列识别底物序列，gRNA与目标DNA完成碱基互补配对，从而实现SpCas9对目标DNA的编辑【1】。后来，通过减轻靶向催化作用削弱了SpCas9对任一基因位点的作用从而产生了包括单碱基编辑、表观遗传编辑等在内的变革性的基因编辑技术【2,3】。目前，SpCas9作为一种基因治疗手段，已经被用于包括HIV，肌肉萎缩症，视觉和遗传性错乱等基因治疗中【4】。然而，由于不断高发的脱靶效应、染色体易位、基因毒性等副作用，对治疗手段尤其是SpCas9的治疗剂量和时空的调控显得十分的重要【5】。

2019年5月2日，来自美国哈佛与MIT的Broad Institute的Amit Choudhary研究团队与合作者在Cell 发表了题为A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9 的研究论文。在该研究中，他们通过一系列生化和细胞水平的测定，筛选出针对SpCas9的小分子抑制剂，使得对于CRISPR-Cas9基因编辑系统有了更加行之有效的控制。

在此项研究中，研究团队通过建立一系列的高通量生化和细胞水平测定方法，筛选出一组多样化的小分子(BRD0539，图1)可以通过识别化合物结构来破坏SpCas9与DNA的结合，从而干扰SpCas9对DNA进行切割。随后，研究者建立了高通量的一级和二级筛选机制。在一级筛选中，他们使用了一种荧光极化技术监测SpCas9与一个荧光团标记的DNA片段（包含PAM序列）的相互作用。筛选出那些破坏SpCas9与DNA结合的小分子抑制剂。在二级筛选中，由于SpCas9会调节调节标记基因处的DNA断裂，所以通过使用自动化显微镜测定细胞中荧光强度的变化可以判断出SpCas9对DNA的切割情况。从而筛选出那些干扰SpCas9切割DNA的小分子抑制剂。

图1

总的来说，通过这一系列的筛选测定，研究人员从对SpCas9具有抑制作用的化合物大类中筛选出一些代表性的小分子抑制剂。其中一种可以抑制SpCas9结合DNA的能力，另一种可以抑制SpCas9切割DNA的能力。由于这些小分子抑制剂可以抑制SpCas9与DNA的结合，使得一些被SpCas9弱化的酶促反应（例如转录的起始）被得到了抑制。

研究人员还发现，这些小分子抑制剂可以稳定地进入细胞，且比过往研究的一些CRISPR蛋白抑制剂(例如 AcrIIA4)要小的多。通过eGFP-disruption实验，一组对细胞进行2-24小时SpCas9+gRNA+BRD0539的荧光破坏追踪，一组对细胞进行2-24小时SpCas9+gRNA+AcrIIA4的荧光破坏追踪。在24小时后，两组重新加入无抑制剂的缓冲液，发现BRD0539抑制剂所在的组的eGFP荧光破坏程度更低（图2）说明BRD0539对SpCas9的抑制作用是可逆的。应用这样的新型化合物抑制剂对SpCas9进行可逆的，剂量可控的，相对稳定且温和的控制，对广泛应用于哺乳细胞的基因编辑，碱基编辑，和表观遗传学编辑具有重要作用。

图2

通讯作者Amit Choudhary在接受采访时表示，这项研究是基于对SpCas9和新一代CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂的快速识别和筛选。因为一些针对CRISPR相关的核酸酶的小分子抑制剂可以被广泛应用到生命科学研究和生物技术的发展之中。然而这些小分子是否可以稳定地被用于人体尚未可知，因而需要进一步的验证。

接下来，研究人员打算研究这些抑制剂在SpCas9:aRNA复合体上的识别位点，探究作用机制且优化其潜在的功能。他们还打算探究是否这些小分子抑制剂在细胞中存在其他的结合位点，来评估他们对其他CRISPR相关核酸酶的特异性功能。