Mol Cell | 王斌博士等揭示生物钟反馈环路中的磷酸化密码

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地球生物生活在昼夜循环的环境里，为了更好的利用外界环境，生物体自身进化出了适应白昼、黑夜的分子系统—生物钟。经过大约30年的研究，生物钟领域已日趋成熟，分子机理研究取得了巨大进展，并于2017年获得诺贝生理或医学奖。

生物钟领域主要有三大问题：1核心生物钟分子机理；2核心生物钟如何感知外界环境；3核心生物钟如何调控其他生理过程。其中第1个问题是过去30年生物钟领域研究的核心。核心生物钟由负反馈调节环组成：转录因子（粗糙脉孢菌的WC-1/WC-2蛋白和哺乳动物的Bmal/Clock蛋白）诱导核心生物钟蛋白（粗糙脉孢菌的frequency蛋白和哺乳动物的period蛋白）转录，核心生物钟蛋白抑制自身转录因子的活性，也就是抑制自身的表达以关闭负反馈调节环【1】。之前的报道发现几种不同的机理用以解释负反馈调节环的关闭，但都只证明了这些机理只是调控而不是决定性的。

为了回答这个问题，美国达特茅斯盖泽尔医学院Jay Dunlap团队（第一作者为王斌博士）在Molecular Cell杂志上发表文章The Phospho-Code Determining Circadian Feedback Loop Closure and Output in Neurospora，利用脉孢菌为研究对象，揭示了蛋白磷酸化在生物钟负反馈环路中的重要作用。

此研究选择了一种真菌—粗糙脉孢菌（Neurospora）作为模式生物，原因是这种生物具有良好的遗传、生化和蛋白质组学的可操作性。之前报道的机理中，核心生物钟蛋白诱导其转录因子磷酸化普遍地存在于不同生物种系统中，所以很可能是一种重要的方式【2】。

研究人员首先利用蛋白纯化技术，从不同暗环境下生长的组织中分离出了转录因子WC-1/WC-2，然后利用质谱技术分析这两个蛋白的磷酸化位点，令人惊讶的是，在这两个蛋白上一共发现了95个位点。为了研究这些位点的生物功能，每一个磷酸化位点分别被突变以消除磷酸化，但消除任何一个磷酸化位点都没有对生物钟表现出严重的影响。研究者进而突变两个蛋白中的任何一个可磷酸化位点，依然没有发现重要的位点。那么另一种可能就是许多位点共同作用。经过多轮的突变实验，终于分离出决定关闭负反馈调节环的磷酸化位点组合。其中WC-1上有一簇位点，WC-2上有两簇位点，这三组位点共同作用，决定负反馈调节环的关闭。核心生物钟蛋白能够诱导其中两组磷酸化。另外，没有预料到的是，除了这三组位点之外的其他磷酸化虽然对于负反馈调节环不起决定作用，但对于核心生物钟调控的生理过程（第二段问题3）起着重要作用。除此之外，此项研究利用灵敏的荧光蛋白技术，发现之前报道的决定生物钟转录因子磷酸化状态的激酶和去磷酸化酶并不起决定性作用，所以很有可能是多个激酶和去磷酸化酶共同作用。

此研究为解答核心生物钟如何运转这一重要问题提供了充足的证据，为进一步研究和利用生物钟奠定了基础。

参考文献

1. Cha, J., Zhou, M., and Liu, Y. (2015). Mechanism of the Neurospora circadian clock, a FREQUENCY-centric view. Biochemistry 54, 150–156.

2. Narasimamurthy, R., Hunt, S.R., Lu, Y., Fustin, J.M., Okamura, H., Partch, C.L., Forger, D.B., Kim, J.K., and

Virshup, D.M. (2018). CK1d/ε protein kinase primes the PER2 circadian phosphoswitch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115, 5986–5991.