非天然氨基酸增强型荧光探针用于蛋白酶体的活性检测

ACS美国化学会  |   2020-08-19 09:00

来源:ACS美国化学会

大家好,今天为大家介绍一篇发表于ACS Chem. Biol.的文章,题为Fluorescent Probes with Unnatural Amino Acids to Monitor Proteasome Activity in Real-Time,本文的通讯作者是来自普渡大学的Darci Trader博士。

蛋白酶体是真核细胞内的蛋白质降解机器,具有多种蛋白水解酶活性。26S蛋白酶体由19S调控复合物(19S RP)20S核心复合物(20S CP)组成。细胞内的受到损伤或错误折叠的蛋白会被修饰以泛素标签,19S RP可识别并去除泛素修饰,随后蛋白底物被20S CP充分水解为较短的肽段。蛋白酶体水解活性的异常往往与疾病相关。例如,癌细胞内的蛋白酶体活性通常处于较高水平,因此,蛋白酶体被认为是重要的癌症治疗靶点。在活细胞内测定蛋白酶体活性对于研究相关疾病具有重要意义。

蛋白酶体20S CPβ5c亚基可特异性识别LLVY四肽序列,并在TyrC端进行水解。最初发展的蛋白酶体活性探针由LLVY四肽和荧光团4-氨基-7甲基香豆素(AMC)连接而成(1A)。在Tyr-AMC之间的酰胺键被20S CP水解后,AMC的荧光得以恢复。随后该策略被应用于开发具有其它亚基选择性的蛋白酶体活性探针,成为了蛋白酶体及其抑制剂研究的重要工具。此类探针存在的最大限制在于AMC的荧光性质较差,因此在细胞实验中通常需要较高浓度处理,一定程度上影响了其选择性,并难以用于活细胞水平的检测。

除了上述基于底物序列的荧光探针,研究者们也开发了一系列基于活性的蛋白酶体探针。这类探针由亚基选择性的蛋白酶体抑制剂与荧光团连接组成,适用于在表达量水平比较蛋白酶体不同亚基的活性。针对以上两类探针的优缺点,作者期望开发一种具有更优荧光性质和更高选择性的活性探针,以便在活细胞水平实时检测蛋白酶体的活性。

2019年,D. Trader博士研究组发展了免疫蛋白酶体(immunoproteasome)选择性的荧光探针TBZ1,该探针应用罗丹明110(Rh110)为荧光团,在其两端分别连接了一段免疫蛋白酶体选择性水解肽段和一段短的拟肽。通过将多肽序列替换为LLVY四肽,作者得到了蛋白酶体20S CP的荧光探针TAS1(1B)。与传统探针Suc-LLVY-AMC比较,TAS1在活细胞中的荧光强度高出数十倍(1C)

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1. 两代蛋白酶体活性探针的结构及荧光强度对比 

为了提高TAS1探针的选择性并拓展其应用场景,作者尝试在该探针的多肽水解位点引入非天然氨基酸,探究非天然氨基酸对荧光探针灵敏度和选择性的增强效果。尽管非天然氨基酸在蛋白酶体抑制剂的筛选中十分常见,但研究者并不清楚哪种类型的非天然结构是更优的选择。

本文中,作者合成了十余种含非天然氨基酸的多肽,非天然氨基酸在LLVY的水解位点即Tyr位进行取代。作者通过LC/MS测试了20S CP对该系列多肽的水解活性,其中Tyr替换为苯丙氨酸,4-氯苯丙氨酸和4-硝基苯丙氨酸的多肽,显示了与原型类似的水解效率(2A)。随后,作者比较了该系列多肽对蛋白酶体的选择性。多肽分别用20S CP10%血清溶液处理,作者发现上述苯丙氨酸类似物的选择性同样表现最佳(2B)。通过两轮筛选,作者选择了4-氯苯丙氨酸和4-硝基苯丙氨酸作为用于活性探针的非天然氨基酸,合成了相应的活性探针TAS2TAS3(1B)

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2. 引入非天然氨基酸的多肽被蛋白酶体水解的效率与选择性

随后,作者利用TAS探针进行了细胞水平的蛋白酶体活性检测。A549细胞用蛋白酶体抑制剂(MG-132, epoxomicin)处理后由三种TAS探针的检测结果如图(3A,B),证实了三种TAS探针对20S CP的选择性。作者同样尝试检测了蛋白酶体激活剂对蛋白酶体活性的影响。三种激活剂(4A)此前曾用于探究GFP融合蛋白的降解效率。作者发现三种激活剂可在不同程度上激活蛋白酶体20S CP的活性,三种探针中TAS3的检测范围最广(4B)

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3. TAS探针用于检测蛋白酶体抑制剂的活性


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4. TAS3探针用于检测蛋白酶体激活剂的活性

最后,TAS探针可作为直接反映酶活的工具应用于不同细胞系中蛋白酶体相对活性的测定。作者利用TAS2测定了6中不同细胞系中的水解速率,其中MM.1R显示了最高的蛋白酶体活性(1)

wt_a82312020081902648_887c1f.jpg1. 不同细胞系的蛋白酶体相对活性 

综上,本文中作者发展一组非天然氨基酸增强型荧光探针用于蛋白酶体的活性检测,非天然氨基酸的引入一定程度上提高了探针的灵敏度和选择性。这组探针可直接用于活细胞内蛋白酶体活性的实时检测,对蛋白酶体抑制剂或激活剂的效应进行有效表征,为蛋白酶体相关研究提供了有力工具。

 

来源:gh_0320d0d498b4 ACS美国化学会

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