ACS Chem. Biol. │ 新型四功能探针助力小分子药物的膜受体鉴定

来源：ACS美国化学会

供稿：王瑞祥，北京大学

本期向大家介绍一篇最近发表于ACS Chem. Biol.的文章，题为“Novel Tetrafunctional Probes Identify Target Receptors and Binding Sites of Small-molecule Drugs from Living Systems”。本文的通讯作者是来自日本大冢制药株式会社的Rin Miyajima和Takashi Hayashi。

图1. 课题整体设计

鉴定小分子药物的作用靶点对于理解药物的作用机制至关重要。得益于蛋白质组学技术的发展，越来越多的小分子药物靶点得以被鉴定出来。然而，存在一部分小分子药物，它们的作用靶点主要为膜蛋白受体，例如某些治疗中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病的药物。由于膜蛋白受体的丰度较低，且水溶性差，所以鉴定小分子药物和膜蛋白受体之间的相互作用存在一定的挑战性。在本文中，作者发展了一种新型四功能探针，用于鉴定小分子药物的膜蛋白受体(图1)。该探针主要包括四部分，小分子药物用于探针靶向，ACT基团用于光交联，Dde基团作为可切割Linker用于提高质谱检测的灵敏度，Biotin基团用于富集受体蛋白。实验结果表明，该探针可以高效且特异地鉴定小分子药物的受体蛋白。

图2. 探针设计与合成

作者首先将目光聚焦到属于GPCR家族的DRD2受体蛋白上，DRD2是一类精神疾病药物的靶点，且已知化合物1 (图2)可以靶向DRD2。基于化合物1，作者合成了一系列探针(图2)，这些探针具有不同的光交联基团，并且光交联基团与小分子药物之间的Linker长度也不同。将上述探针与细胞共孵育，紫外光照后利用Biotin基团富集膜蛋白，再通过蛋白质谱鉴定探针标记受体的效率(图3)。实验结果表明，探针2b和3b对已知受体DRD2的标记与富集效率最高，结合竞争实验表明2b和3b对DRD2的标记是特异的。基于ACT基团的探针2b鉴定到了5个受体蛋白，而基于Diazirine基团的探针3b鉴定到了约50个蛋白，作者认为探针2b虽然仅鉴定到了5个蛋白，但是可信度较高，这意味着探针2b鉴定受体时的选择性较好。最终作者选取了基于ACT基团的探针2b进行后续的研究。值得注意的是，ACT基团主要与蛋白中的Asp和Glu进行交联，而膜蛋白的膜外区含有比较高丰度的Asp和Glu。

图3.探针表征与筛选

之后，作者进一步对探针2b进行了改造。作者发现，使用链霉亲和素磁珠富集靶蛋白后，需要使用高温条件洗脱，而高温洗脱会使质谱样品中混入大量的链霉亲和素，磁珠的非特异性蛋白吸附也会被引入质谱样品，这些杂质蛋白的引入会显著降低质谱鉴定的灵敏度。于是作者在探针2b中引入了可断裂基团Dde (图1)，Dde基团与肼反应会发生断裂，从而避免了使用高温条件洗脱蛋白，质谱鉴定的灵敏度得到了显著提升。至此，新型四功能探针发展完成。

图4. 靶向AMPARs与GABAARs的四功能探针

最后，作者将目光聚焦于两类CNS疾病相关的神经受体，(AMPA)-type glutamate receptors (AMPARs)和β-aminobutyric acid (GABA) type A receptors (GABAARs), 作者基于这两类受体的已知药物配体合成了四功能探针(图4)，两种四功能探针均可以在脑片组织中灵敏且特异地鉴定到其对应的靶标膜蛋白受体。

综上，本文发展了一种新型四功能探针，用于鉴定小分子药物的膜蛋白受体。由于膜蛋白的特殊性，作者优化了光交联基团的使用并最终得到一种具有高灵敏度与选择性的探针。该探针可以在脑片组织中成功鉴定到CNS药物的神经细胞受体。本文发展的四功能探针可以被应用于后续小分子药物的受体鉴定与作用机理研究，本文的探针设计思路也具有重要的参考价值。