Cell Stem | 单细胞谱系追踪解析造血干细胞命运与转录组特征

来源：BioArt

责编 | 兮

多细胞生命是从单个细胞开始，通过细胞分裂和分化，最终形成组织分明、井然有序的个体。在这个过程中细胞的发育历史被称为谱系 (lineage)。记录、追踪并绘制细胞发育历史的过程被称为谱系追踪 (lineage tracing) 。近年来科学家通过发展谱系追踪的方法学，深入理解了干细胞驱动的器官再生与稳态，推动了体外迷你器官培养的进步。在癌症领域，谱系追踪揭示了肿瘤细胞的起源和克隆演化，提供了靶向肿瘤干细胞的新型肿瘤治疗策略。但由于传统的谱系追踪工具缺乏足够高的分辨率，解析谱系组成复杂且高度动态的复杂系统（如血液与免疫系统）仍有很大挑战。

为解决这一技术挑战，德国癌症研究中心Hans-Reimer Rodewald研究组与Thomas Höfer研究组于2017年在Nature上发表了一项细胞内源DNA条形码 (barcode) 技术——Polylox (第一作者为裴唯珂博士) 。该技术基于Cre重组酶的随机重组原理，可在体内产生超过100万种序列随机的重组产物——即Polylox条形码。通过测序追踪条形码在体内的流向，即可实现高分辨率重建复细胞发育轨迹并在克隆水平解析细胞发育命运。

然而Polylox条形码技术虽可以揭示细胞的发育命运，但无法回答细胞命运决定背后的分子机制。近年来高速发展的单细胞组学技术可以提供基因表达的“快照”，为发育生物学的研究翻开了崭新的一页。但是单细胞测序技术缺乏细胞谱系（祖代细胞-子代细胞关系）信息，因此单时间点的单细胞转录组数据尚不足以揭示细胞在连续时间轴上的发育命运。

为双管齐下同时解析细胞命运和基因表达，2020年8月11日，Hans-Reimer Rodewald与Thomas Höfer研究组再度联手（裴唯珂、商傅伟、王曦为共同第一作者）在Cell Stem Cell杂志上发表文章Resolving Fates and Single-Cell Transcriptomes of Hematopoietic Stem Cell Clones by PolyloxExpress Barcoding ，报道了一种内源RNA条形码工具——PolyloxExpress。该工具在Polylox系统的基础上，将 DNA条形码表达为RNA条形码。通过单细胞测序技术捕获单个细胞的转录组，并利用RNA条形码的流向确定每个细胞的发育命运，该工作实现了在单细胞水平整合细胞谱系信息与基因表达信息（图1A, B）。

图1. PolyloxExpress系统同时解析细胞谱系信息与基因表达信息

作者们将PolyloxExpress RNA条形码系统用来研究自然状态下造血干细胞命运决定的基因表达调控（图1C）。造血干细胞 (Hematopoietic stem cells, HSC) 是建立并维持血液系统与免疫系统的成体干细胞，具有自我更新的能力以及分化成淋巴系、髓系、红系等多种血液谱系的发育潜能。理解造血干细胞在自然状态下命运决定的调控机制是临床上成功应用造血干细胞治疗白血病等血液疾病的关键。作者们用Tie2-MeriCreMer小鼠驱动PolyloxExpress条形码标记造血干细胞，通过谱系追踪实验发现造血干细胞按发育命运主要分为三类：产生所有谱系的多谱系造血干细胞(multilineage)；只产生髓系细胞和红细胞的髓系-红系造血干细胞 (myelo-erythroid restricted) ；以及分化不活跃的造血干细胞 (differentiation-inactive) 。作者基于造血干细胞的基因表达变化进行主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA) 发现只凭转录组信息本身无法准确区分命运不同的造血干细胞。接下来通过在造血过程的单细胞转录组图谱上注释细胞的发育命运，作者们发现这三类命运不同的造血干细胞克隆分别占据了转录组图谱的特定区域，表明这些细胞亚群具有命运特异的转录组特征（图2）。

造血干细胞有巨大的功能异质性。依照骨髓移植后造血干细胞自我更新能力的持续时间，可分为长期造血干细胞（可重建多代受体的血液系统）和短期造血干细胞（仅可重建一代受体的血液系统）两大亚群。而通过对干细胞增殖的脉冲-追踪实验鉴定了一群分裂缓慢、只响应刺激的休眠 (proliferation-dormant) 造血干细胞。作者们通过比较这些造血干细胞类型的基因表达谱发现PolyExpress谱系追踪鉴定的多谱系、髓系-红系以及非活化造血干细胞并不单纯属于任何以上描述的干细胞类型。该结果表明基于谱系追踪的造血干细胞分类比传统的基于功能的分类更适用于描述其发育生物学特性（图3）。此外，作者还首次揭示了自然状态下造血干细胞分裂与分化的关系。作者们发现分裂缓慢的休眠造血干细胞也会分化为成熟细胞并参与整个造血过程；而分化不活跃的干细胞也会进行对称性分裂以维持自我更新和造血干细胞池的稳态。

图3. 不同造血干细胞类型的转录组特征比较

最后，通过分析造血干细胞的转录组特征鉴定了细胞命运相关的差异表达基因，作者提供了分离不同发育命运的造血干细胞的候选生物标记以及潜在的细胞命运决定的调控基因。这项研究与近期基于CRISPR/Cas9的单细胞谱系追踪工具一起（详见BioArt报道: Science | 细胞分化过程中状态图谱与细胞命运图谱；Cell新技术 | 双管齐下：细胞谱系追踪与单细胞表达谱；Nature 丨单细胞谱系追踪发现TCF5在造血作用中的重要功能），为研究造血干细胞的命运决定机制提供了新的方向和研究手段。

总的来说，该工作建立的以Cre-lox系统为基础的PolyloxExpress小鼠品系，可以在非侵入的生理状态下，对多细胞系统的发育过程进行全面追踪，并解析细胞命运选择背后的转录调控。该工具的核心优势在于具有极大的可延展性。通过结合现存的庞大Cre小鼠品系，PolyloxExpress是可以用于对所有器官组织、以及从胚胎发育到个体衰老的所有发育阶段进行细胞命运与谱系研究的平台型工具。比如，肿瘤生物学家可以通过条形码标记原发肿瘤，追踪肿瘤细胞的细胞竞争和克隆演化，并解析不同肿瘤克隆对药物响应的分子机制。神经生物学家可以用条形码标记大脑并探索不同起源的神经细胞对神经炎症等应激条件的响应。