NAR | 李祥/刘政等揭示琥珀酰化对于核小体和染色质动态结构的影响

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核小体是真核细胞染色质的基本结构单元。作为遗传物质的重要载体，核小体由DNA包裹组蛋白八聚体而构成。核小体的结构处于动态平衡中以调节与DNA相关的生物学进程，包括基因表达，DNA复制和DNA损伤修复等。广泛的研究表明组蛋白的翻译后修饰（posttranslational modifications, PTMs）是调节核小体动态结构的重要机制，能够影响组蛋白之间的相互作用，DNA和组蛋白之间的相互作用以及染色质高级结构的形成【1】。
多种翻译后修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化等，被发现存在于组蛋白上。相较于上述翻译后修饰，赖氨酸琥珀酰化(succinyl-lysine，Ksucc)是一种较新发现的蛋白修饰。赖氨酸琥珀酰化最初是在与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle），脂肪酸代谢和氨基酸降解相关的线粒体蛋白中发现的，这意味着Ksucc可能在多种代谢途径中有重要作用【2】。后续研究显示Ksucc亦分布于组蛋白上【3】，并且细胞沉默调节蛋白5(SIRT5) 可以催化该修饰的去除【4】。早期研究表明琥珀酰辅酶A（succ-CoA）可以在体外非酶促条件下修饰蛋白，但最近有关琥珀酰转移酶（succinyltransferase）的研究取得重大突破：2017年MD Anderson肿瘤中心Zhimin Lu课题组在Nature上报道了赖氨酸乙酰基转移酶2A（KAT2A，也称为GCN5）可以特异性地催化组蛋白H3 K79的琥珀酰化来促进肿瘤的发展【5】。2018年，肉碱棕榈酰转移酶（CPT）1A被揭示在体内外均具有琥珀酰转移酶的功能【6】。随着研究的深入，越来越多的临床数据表明，赖氨酸琥珀酰化与多种疾病的发展有关，包括癌症和神经性疾病等。
截至目前，有关翻译后修饰对核小体动态结构的影响主要集中于赖氨酸乙酰化(acetyl-lysine，Kac)。相较于乙酰化, 琥珀酰化不仅结构位阻更大，而且在生理条件下，将带正电的赖氨酸侧链转变为带负电，已有研究表明该物理特性的转变在特定位点能够削弱组蛋白与核小体DNA之间相互作用，从而影响核小体结构的稳定【7】。鉴于赖氨酸琥珀酰化具有重要的生物学功能，并且分布于组蛋白的许多位点上，研究特定位点赖氨酸琥珀酰化对核小体动态结构的具体影响十分有必要，并且对于揭示赖氨酸琥珀酰化的生物学作用机制有重要意义。
2020年8月8日，香港大学化学系教授李祥（Xiang David Li）团队联合其在香港科技大学的Toyotaka Ishibashi在Nucleic Acids Research杂志发表了题为 “Semisynthesis of site-specifically succinylated histone reveals that succinylation regulates nucleosome unwrapping rate and DNA accessibility”的文章。该文章利用蛋白化学合成的方法合成了第77位赖氨酸 (K77)琥珀酰化修饰的组蛋白H4（H4K77succ），并利用多种生物化学和生物物理学手段在体内外系统地表征了琥珀酰化对于核小体和染色质动态结构的影响。

核小体的晶体结构显示组蛋白H4的第77位赖氨酸 (H4K77) 位于组蛋白和核小体DNA的静电相互作用界面上，并且靠近核小体二分位点（dyad）。已报道的研究显示第77位赖氨酸 (K77)乙酰化修饰的组蛋白H4能够增强染色质结构的稳定性【8】，为研究该位点琥珀酰化对于核小体动态结构的影响，李祥课题组首先利用较为成熟的表达蛋白连接(expressed protein ligation, EPL)技术合成了第77位赖氨酸 (K77)琥珀酰化修饰的组蛋白H4（H4K77succ）。

利用得到的琥珀酰化修饰的组蛋白（H4K77succ），研究人员通过组装核小体，并利用荧光共振能量转移方法（Fluorescence resonance energy transfer,FRET），定量研究该位点的琥珀酰化修饰对核小体结构的稳定性的影响程度。实验结果显示，相比于不含修饰的组蛋白构成的核小体，琥珀酰化修饰在K77位点会降低核小体结构的稳定性，使核小体在更低的盐浓度条件下就开始解聚。此外，FRET实验还发现了一个很有意思的现象：H4K77succ促进了组蛋白H2A–H2B二聚体从核小体解聚脱离。

鉴于H4 K77位点位于组蛋白八聚体和核小体DNA 的接触界面上，因此推测上述现象的内在可能原因为H4K77succ破坏了组蛋白八聚体和核小体DNA 的相互作用，促进了核小体DNA从核小体解缠分离，进而推动了H2A–H2B二聚体从核小体解聚脱离，这也是导致核小体稳定性降低的根本原因。后续的FRET实验，“One-pot’ assay”实验和“光镊”实验（Optical tweezers）同时验证了上述猜想。
在芽殖酵母中，研究人员将赖氨酸突变为谷氨酸（H4K77E突变）来模拟琥珀酰化修饰，发现该突变会导致端粒区域的基因转录水平上升，同时影响DNA损伤修复。进一步的实验证明，此突变可增强组蛋白H2A–H2B二聚体从核小体的解离来影响染色质的聚集及基因的转录。体内外实验结果共同证明了H4K77succ通过促进核小体DNA的解缠分离而降低核小体的稳定性。
李祥课题组的博士后研究员刘政为该文章的共同通讯作者。共同第一作者分别是李祥课题组的博士研究生敬艺行和田高飞，以及香港科技大学Toyotaka Ishibashi组的博士研究生丁栋博。