1981年人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸

1981年11月20日，我国继1965年在世界上首次合成蛋白质—结晶牛胰岛素后，又在世界上首次合成核酸—酵母丙氨酸转移核糖核酸。这一历时13年，由4个研究所、1所大学和1个工厂共同参与并最终完成的科研成果，凝聚了我国科技工作者的集体智慧，同时也体现了他们严谨的科学态度，得到了国内外专家的一致肯定。该成果获得1984年中国科学院重大科技成果奖一等奖、1987年国家自然科学奖一等奖和1991年陈嘉庚生命科学奖。

向生命基质—核酸进军

1965年，我国在世界上首次合成蛋白质—牛胰岛素，并获得与天然牛胰岛素完全相同的结晶。此后，中国科学家开始思考下一步工作，经过各界的热烈讨论，与蛋白质同为生命活动最基本物质的核酸的合成工作，进入了科学家的视野。

▲酵母丙氨酸转移核糖核酸的结构图

要合成核酸，就要选择合适的合成对象，合成对象的正确与否直接关系到实验的成败。科研小组选择了酵母丙氨酸转移核糖核酸（tRNA_y^Ala）。这是因为：人工合成DNA虽然比合成RNA容易得多，但当时还没有一个DNA分子的序列被测定，直到1977年，第一个DNA全序列才由英国桑格工作组完成，而tRNA_y^Ala作为世界上第一个被全序列测定的RNA分子，其测定工作已由美国霍利领导的工作组于1965年完成；tRNA分子较小、功能明确，易于在实验室里测定其生物活性，同时tRNA表现功能时与其他许多生物大分子有密切关系，可为进一步开展tRNA的结构与功能研究创造有利条件；此外tRNA_y^Ala来源于酵母，含量较高，比较容易提取和制备。于是，tRNA_y^Ala就成为合成核酸的首选考虑对象。

1967年，人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸课题上报国家科委，1968年年初国家科委批复同意开展此项研究，1968年秋中国科学院发文批准这项研究课题，并指定上海由当时的生物化学研究所负责，上海实验生物研究所（后改名为上海细胞生物学研究所）和上海有机化学研究所参加；北京由当时的生物物理研究所负责，微生物研究所、遗传研究所和动物研究所参加。1978年，经过调整，中国科学院保留四个研究所参与工作，即上海生物化学研究所、上海细胞生物学研究所、上海有机化学研究所和北京的生物物理研究所。此外，北京大学生物系和上海化学试剂二厂也先后参加本项工作。

“环卫”科学家首次合成核酸

tRNA_y^Ala由76个核苷酸组成，除了4种常见核苷酸—腺苷酸（Ap）、鸟苷酸（Gp）、胞苷酸（Cp）和尿苷酸（Up），还含有7种（9个）稀有核苷酸—1个1-甲基Gp（m¹Gp）、2个二氢Up（Dp）、1个2-二甲基Gp（m²₂Gp）、1个肌苷酸（Ip）、1个1-甲基肌苷酸（m¹Ip）、2个假尿苷酸（ψp）和1个核糖胸腺苷酸（Tp）。基于tRNA_y^Ala的这一特殊结构，同时结合国外已有成果，研究小组确定了先分头合成两个半分子（5'半分子和3'半分子），然后将它们连接得到完整的tRNA_y^Ala分子的大路线。

合成路线确定之后，合成原料核苷酸的生产就成为第一步工作。这主要是由东风生化试剂厂与上海化学试剂二厂承担的。这方面的工作非常艰难。拿假尿苷酸的生产来说，它需要用人尿为原料，人尿中假尿苷含量高，经过磷酸化才能得到假尿苷酸。于是研究人员在公共厕所放了一些桶收集人尿，然后再分离。由于用量很大，同时为了克服公共厕所收集到的人尿可能带病的问题，研究人员后来找到上海警备区合作。研究人员放了几个桶到部队的厕所里，定期去拿，然后用卡车拉到上海试剂二厂。可以说，研究人员合成tRNA_y^Ala的工作是从做“环卫工人”起步的。

▲中国科学院院士、生物化学家王德宝（右二）与科研人员在一起

在具体的合成方法上，研究小组最初采用了化学合成的方法。但实践证明，这一方法效率很低，不仅合成产率低下、副反应多（它比脱氧核糖核苷酸多了一个2'位羟基），而且副反应产生的集团还非常活跃，必须加以保护，此外稀有核苷酸的保护也是化学反应必须考虑的内容。面对困难，研究小组又把目光投向了刚发现不久的RNA连接酶。王应睐、王德宝给他们认识的一位美国科学家写信，得到了相关的菌种。之后，研究小组制备出了RNA连接酶。研究人员首先使用化学或酶促方法合成了许多小片段，随后用RNA连接酶先将小片段拼接成中片段，得到了两个半分子，然后再将两个半分子相连接就得到了tRNA_y^Ala整分子。经专家鉴定，人工合成得到的tRNA_y^Ala分子与天然的tRNA_y^Ala分子结构完全相同，而且合成的产物具有高达70％～80％的生物活性。这标志着我国继1965年9月在世界上首次合成蛋白质后，又在世界上首次合成了核糖核酸分子—tRNA_y^Ala。

这项工作的创新点主要是：

在合成路线的试探过程中，用天然分子做模型，确定了半分子合成路线，为全合成打开了通路。

分子中含有位置正确的7种（9个）稀有核苷酸。实验结果表明稀有核苷酸对于tRNA的活性是至关重要的，这也是我国工作与外国同类工作的最大差别。

对T4 RNA连接酶的性质进行了非常深入的研究，提出并坚守将该酶用于合成工作的信念，并把化学与酶促合成方法有机结合起来，最终取得成功。

发展了合成和测定活性的少量和微量方法。最终找到一个只需7微微克（7×10^-12摩尔）样品即可测定生物活性的方法。这大大节省了样品，也节省了合成的工作量。

13年磨一剑奠定中国核酸合成世界领先地位

20世纪后期，国外也在进行类似的tRNA人工合成研究。如1981年日本科学家合成了一个大肠杆菌甲酰甲硫氨酸tRNA分子，但其活性只有天然tRNA的6％，且合成产物不含天然分子稀有核苷酸。1988年加拿大科学家合成的tRNA也不含核苷酸，活性只有天然的11％。1992年法国科学家合成的大肠杆菌丙氨酸tRNA虽含有76个核苷酸，但只有3个稀有核苷酸，活性只有天然的42％。因此，我国的这项成果无论在完成时间还是在生物活性结果上，都居于世界领先地位。

该成果先后获得1984年中国科学院重大科技成果奖一等奖、1987年国家自然科学奖一等奖和1991年陈嘉庚生命科学奖。此外，王德宝由于领导tRNA_y^Ala的人工全合成工作所取得的突出成果，于1996年获何梁何利基金科学与技术进步奖（生命科学奖）。1998年11月25日，王德宝向中国革命博物馆捐赠了他珍藏的、在人工合成tRNA_y^Ala工作中撰写的文章、材料底稿，以及中国科学院领导给他的贺信。