肿瘤免疫疗法诱发肠炎反应的分子机制

来源：BioArt

目前，对于一些恶性肿瘤如黑色素瘤，虽然通过采用阻断内源性的免疫抑制因子CTLA-4和PD-1/PD-L1的抗体类药物来重新激活免疫反应的免疫疗法能明显延长患者的生存期，但是采用该疗法同时会因增强免疫系统的活性而引发炎性反应等副作用，即免疫检测点阻断诱发的免疫相关不良事件（immune-related adverse events，irAEs）【1】。据报道，在接受抗CTLA-4和PD-1药物治疗的病人中，大约有60%的病人会诱发严重的毒性反应。尽管相关病人的所有器官都可能受到irAEs的影响，但irAEs最常诱发肠道炎症反应 （checkpoint inhibitor-induced colitis，+CPI colitis）【2】。在接受免疫治疗的病人中，大约有10%-20%的病人最终会发展成严重的colitis并可能危及生命【3】。然而，有关irAEs的诱因至今依然不清楚，并且在经过免疫疗法处理的小鼠体内没有发现相应的irAEs【4】，因此很难运用合适的动物模型去解析引发+CPI colitis和其他irAEs的分子机制。

2020年6月29日，哈佛医学院和Dana-Farber癌症研究所的Kai W. Wucherpfennig、Guo-Cheng Yuan与麻省总医院Michael Dougan合作（共同一作为Adrienne M. Luoma和Shengbao Suo博士）在Cell上发表文章Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy，通过运用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和流式细胞技术（flow cytometry）直接分析了近期采用免疫疗法的癌症病人的肠道活体样本，深入解析了诱发+CPI colitis的细胞和分子通路并预测了潜在的治疗靶点。

为了从不同层面对比分析诱发+CPI colitis的原因，所有样本被分成三组：正常对照人群（Control），患有黑色素瘤并经过免疫治疗后没有引发肠道炎性反应的病人（+CPI no colitis），以及有诱发肠道炎性反应的病人（+CPI colitis）。首先通过对所有样本中CD45+免疫细胞的分析，发现Control组和+CPI no colitis组具有非常相似的转录组图谱，而在+CPI colitis组却能观察到非常显著的T细胞和骨髓细胞（myeloid cell）富集情况，因此该结果表明肠道内某些免疫细胞组成的变化与+CPI colitis的产生具有很强的相关性。

随后，为了进一步分析T细胞在不同组之间的差异性，根据T细胞分化轨迹，所有CD3+ T细胞被细分为CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。通过对CD8+ T细胞的聚类以及不同细胞类型组成分析发现，高表达GZMB和IFNG基因的毒性T细胞（cytotoxic T cells）和增殖T细胞（cycling T cells）几乎完全富集在所有+CPI colitis样本中。与之相反的是组织常驻记忆T细胞（tissue-resident memory T cells，Trm）的含量却在+CPI colitis样本中表现出明显的下降趋势。此外，通过流式细胞术实验验证了以上观察到的现象，这潜在说明了+CPI coliti 病人中的Trm和毒性T细胞/增殖T细胞之间存在某种迁移转化关系。

调节T细胞（regulatory T cells，Treg）是一群具有负调控免疫反应的淋巴细胞，其主要存在于CD4+ T细胞中。有关小鼠模型研究表明，抗CTLA-4免疫治疗能够导致小鼠肿瘤里面Treg细胞的消失【5】，因此irAEs的产生被认为与体内Treg细胞的消失有一定程度的联系【6】。然而有意思的是，在对CD4+ T细胞的分析发现，FoxP3+ Treg细胞比例和FoxP蛋白表达量在+CPI colitis样本中均有显著提升。Treg单细胞转录组分析也进一步识别出了+CPI colitis特异性的具有T help1细胞活性的Treg亚细胞群。该结果表明在肿瘤免疫疗法引发的肠炎反应并不是由Treg细胞比例的降低导致的，炎性微环境影响了Treg细胞本身的表达图谱。

T细胞受体（T cell receptor，TCR）信号通路的激活能引起T细胞的大量增殖，每个T细胞都有自身的TCR序列，因此可以通过TCR的序列信息来分析+CPI colitis相关的T细胞类型产生的原因以及细胞之间的分化轨迹。基于TCR的数据分析表明，在+CPI colitis 样本的CD8+ T细胞中，94.2%的增殖T细胞与毒性T细胞具有相同的TCR序列信息，这说明在这两种细胞类型之间存在明显的动态转变关系。另外有趣的是，在+CPI colitis 样本中，有大量的Trm细胞与增殖T细胞和毒性T细胞共用相同的TCR序列，而在其他两组对照样本中并没有发现相关的现象。该结果表明在+CPI colitis 样本中，部分增殖T细胞与毒性T细胞的产生是由Trm细胞的直接分化导致，从而解释了在免疫治疗早期就能在病人肠道中观察到炎性症状的原因。

此外，通过对所有CD45+免疫细胞的分析发现，骨髓细胞能够显著性富集IFNγ和TNFα信号通路因子。在+CPI colitis 样本中，骨髓细胞显著性高表达趋化因子CXCL9和CXCL10，而这两个基因的表达能够通过配体-受体结合的方式招募CXCR3+效应T细胞（effector T cells）。通过对骨髓细胞的进一步分析发现，在+CPI colitis 样本中能识别一组特异性的巨噬细胞，这组巨噬细胞能高表达可诱导IFN信号通路的CXCL9和CXCL10基因。因此该结果显示，在+CPI colitis 样本中，IFN信号通路能够改变巨噬细胞的转录组图谱并进而通过表达相关趋化因子来招募更多的T细胞到达炎性部位。

接着，通过对比分析发现趋化因子受体基因CXCR6同样能够在+CPI colitis的T细胞中高表达，而受IFN和TNF信号通路调控的CXCR6配体基因CXCL16在骨髓细胞和肥大细胞（mast cells）中也表现出显著性高表达特征。有趣的是，CXCR6在多种人类癌症细胞中都出现高表达，该基因的表达能够反映癌症细胞转移情况【7】，因此以CXCR6作为潜在的治疗靶点进行抑制可能会降低癌细胞的转移并有效改善肠道炎症情况。

综上所述，该工作首次从单细胞水平详细探讨了肠道样本中不同免疫细胞因免疫治疗引起变化的机制，发现了毒性CD8+ T细胞，增殖CD8+ T细胞以及CD4+ Treg细胞在+CPI colitis样本中的富集，并且基于TCR序列信息验证了+CPI colitis特异性以及CD8+ T细胞大部分来源于CD8+ Trm细胞，最后通过对不同细胞因子的分析识别出了潜在的因免疫检测点阻断诱发的肠炎或其他irAEs的治疗靶点（图1）。

图1: 解析癌症免疫疗法诱发的肠炎反应的分子机制