基于单分子荧光探针用于神经元线粒体内的同时定量检测与实时荧光寿命成像

来源：X一MOL资讯

线粒体氧化还原稳态与能量代谢对于生物体而言是至关重要的，这是因为线粒体是各类活性氧物种（reactive oxygen species，ROS）与直接能量来源ATP产生的最主要场所，ROS控制着氧化还原稳态而ATP则主导着能量代谢，这两大生理活动是线粒体的中心事件。事实上，在一些神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）中，细胞均表现出异常的氧化应激和能量代谢受损。因此，对这些事件相关分子的研究不仅为疾病的病理机制提供了相关解析，而且也为靶向性和治疗性药物的开发提供新策略。H2O2，作为相对来说较为稳定的ROS，是维持线粒体氧化还原过程的主要分子之一，也是线粒体氧化损伤的重要信使。另一方面，ATP则是调节线粒体能量代谢的重要信使。值得一提的是，H2O2与ATP有着密切的相互联系。在线粒体呼吸链中，生成ATP的同时并伴随着超氧阴离子（O2•-）的产生，而O2•-会迅速地与SOD发生歧化反应转换为H2O2，更高的代谢速率会导致更多H2O2的产生。此外，ATP的合成受损也反过来导致线粒体膜电位的变化进而引起H2O2的增加。与此同时，过量的H2O2会进一步损伤线粒体内的相关酶，蛋白质和DNA等，影响线粒体的正常生理功能，同样使得ATP的合成难以进行。因此，同时监测线粒体内H2O2和ATP含量的实时动态变化具有重要意义。

图1. TFP探针工作原理示意图。
近日，华东师范大学的田阳教授课题组成功设计并合成了一种基于双光子荧光寿命探针（TFP），该单个探针可同时用于H2O2与ATP的高准确度、高选择性的检测（图1）。TFP探针主要由三部分组成：线粒体靶向部分、H2O2响应部分和ATP响应部分。由于线粒体膜电位为高度负电性，探针的吡啶阳离子有助于其在线粒体内聚集，具有靶向线粒体的作用。H2O2响应部位是萘酰亚胺荧光团衍生物，该部位的苯硼酸酯可以抑制荧光团的荧光。由于H2O2可以选择性地与苯硼酸酯发生反应将其脱去，这就使得萘酰亚胺荧光团的荧光恢复。ATP响应部位是二乙烯三胺修饰的罗丹明螺环衍生物，该衍生物具有多个氨基，很容易捕获ATP。这主要是由于ATP的多个磷酸基团可以和氨基形成氢键，迫使螺环内酰胺被打开，同时ATP的嘌呤结构可以与罗丹明荧光团部位形成π-π堆积作用，最终产生荧光。由于TFP探针的萘酰亚胺与罗丹明荧光团具有很好的光谱分离效果，因此并未发生荧光共振能量转移，在710 nm的双光子激发波长下，探针不同成像通道的荧光强度与平均荧光寿命对0.4-10 μM H2O2和0.5-15 mM ATP均呈现了良好的线性关系，可完成两种分子的同时定量检测。随后，研究人员将该探针运用到神经元细胞内荧光寿命成像，研究了不同状态下线粒体内H2O2和ATP的含量变化，并实时观察了它们在O2•-诱导刺激下的动态变化。研究发现，在短时间内（8分钟）的O2•-刺激下，线粒体内H2O2和ATP的含量会暂时有所改变，而神经元完全有能力在短时间内恢复到初始状态。然而，当O2•-刺激时间增加到50分钟时则会导致神经元永久性氧化损伤和能量匮乏（图2）。同时，研究还发现外源性O2•-和H2O2刺激对线粒体功能有不同的影响，相同条件下，O2•-对神经元造成的损伤远比H2O2严重。此外，由于TFP探针的双光子吸收性能，其可用于分析正常氧和缺氧条件下幼体斑马鱼体内H2O2和ATP的水平。事实上，这项工作不仅为多物质同时成像提供了一种通用的分子设计方法，而且还揭示了氧化应激状态下线粒体内H2O2和ATP相关变化。

图2. O2•-诱导刺激下神经元线粒体内H2O2和ATP实时荧光寿命成像。
相关研究成果发表在Journal of the American Chemical Society上，同时也被JACS的Spotlights专题介绍，文章的第一作者是华东师范大学的硕士研究生吴洲，通讯作者为田阳教授。