Cell :全基因组筛选揭秘内质网自噬分子调控机制

选择性细胞器自噬的失调会对细胞适应性产生负面影响，且与神经退行性疾病的发生和发展息息相关。举例来说，线粒体自噬相关基因如PINK1和Parkin发生突变会造成人体产生帕金森等疾病的发生【3,4】。

内质网在体内多种生物学过程中都担纲重要角色，比如钙的存储、脂质的生物合成、分泌蛋白和膜蛋白的成熟和运输等方面都离不开内质网的正常运转【5】。内质网自噬（Autophagy of the ER, ER-phagy）的研究其实最早在开始于15年前，是在酵母中进行的研究【6】。

而一直到近年来关于内质网自噬的研究才在哺乳动物细胞有所进展【7】（所以各位研究生小白们不要着急，令你扬名立万的科学研究现在可能还处在“幼儿园”萌芽阶段）。但关于内质网自噬的相关调节信号通路的研究还并不非常清楚。

2020年3月10日，加州大学伯克利分校Jacob E. Corn研究组在Cell上发表文章A Genome-wide ER-Phagy Screen Highlights Key Roles of Mitochondrial Metabolism and ER-Resident UFMylation，针对内质网自噬以ER-phagy报告基因为筛选背景展开了全基因基础的筛选，发现并鉴定出200多个与人类内质网自噬相关的因子，揭开了内质网自噬依赖于UFM1类泛素化类似修饰蛋白信号通路的相关分子机制。

为了揭开内质网自噬调节相关的信号通路，作者们进行了一个全基因组CRISPR干扰 (CRISPRi) 为基础的筛选。记得北京生命科学研究所的王晓东老师曾经说过：“if you run out of idea, do a screen”(另一个流传的版本是，邵峰老师曾说过的，“当研究没有什么头绪的时候，就去做个筛选吧”)。筛选这条路子几乎百用不废，通过大规模的筛选科学家们可以得到一个与研究目标相关的一个宝库。

而通过筛选得到的靶标基因或者药物等的方式所具有的系统性、广泛性是其他实验所不能比拟的。一个好的筛选方案需要具备哪些特点？首先，有一个可靠的筛选背景，比如筛选报告基因、筛选细胞品系；其次，有良好的实验对照（空白对照、阴性对照与阳性对照）；最后，筛选结果有明确的可读性，比如通过报告基因荧光数值变化、细胞存活数量计数、产生反应颜色等等。当然，为了确保实验的顺利进行，在进行大规模筛选之前可以进行一个小规模的预实验，对实验系统进行检测和确认。

作者们以2018年发表的一个内质网自噬串联报告基因系统（ER-autophagy tandem reporter system，EATR）【8】进行全基因组筛选（图1）。在细胞中稳定表达药物诱导的EATR质粒，其中包括mCherry和eGFP两种连接在内质网定位蛋白之上。在细胞质中，细胞内的pH值表现为中性，可以观察到由内质网定位蛋白mCherry和eGFP的同时表达出现黄色信号。

而在溶酶体中，其环境为偏酸性，此时eGFP淬灭因而只表现出红色。dCas9-KRAB质粒在细胞中的稳定表达是为了确保sgRNA靶向基因的转录抑制（图1）。通过筛选，作者们找到了与内质网自噬相关的约200个基因。通过Gene ontology分析，作者们发现，与内质网自噬相关的基因主要可以分为以下几个类群：自噬执行相关基因；泛素化修饰；线粒体代谢与氧化磷酸化相关的基因；泛素类似蛋白UFM1相关的蛋白翻译后修饰相关基因。
图1 内质网自噬报告基因筛选系统
作者们惊讶地发现，很多与内质网自噬相关的蛋白都是氧化磷酸化过程相关因子。因此，作者们希望找出内质网自噬与线粒体代谢过程之间的联系。通过遗传学敲低氧化磷酸基因或者化学药物施用破坏氧化磷酸化过程，作者们发现线粒体的氧化磷酸化过程可以促进内质网自噬。另外，使作者们非常惊讶的是通过敲低氧化磷酸化组分引发的内质网自噬减少并不依赖于AMPK信号通路。

除了与线粒体代谢相关的因子之外，作者们还筛选到了一些定位在内质网或者与内质网功能相关的一些因子，其中就包括与内质网稳态相关的DDRGK1【9】。作者们通过免疫染色实验发现DDRGK1与内质网共定位。而且之前有研究表明，DDRGK1可以被通过类泛素化蛋白UFM1修饰，对于其他因子的进一步UFM1修饰也是非常关键的【10】。UFM1类泛素化修饰包括激活、结合和连接过程，与泛素化过程类似，UFM1修饰也需要E1（UBA5）、E2(UFC1)和E3（UFL1）的参与（图2）。

而且DDRGK1的UFM1修饰也依赖于其存在的赖氨酸（K）位点。通过生化实验，作者们的确发现内质网自噬过程中DDRGK1会发生UFM1修饰，但是在敲除了UFM1后，DDRGK1的表达丰度未受影响，敲除E3连接酶UFL1之后也不会对此修饰的水平造成影响。突变DDRGK1中所有保守的赖氨酸位点也不会影响其与E3连接酶UFL1之间的相互作用。这些结果让作者们意识到一点，DDRGK1未必是内质网自噬过程中UFM1修饰的靶点，而可能是作为E3连接酶UFL1适配器（Adaptor）而非底物发挥作用的。通过实验作者们发现，DDRGK1通过其中一个结构域在内质网自噬过程中招募E3连接酶UFL1到内质网上激活UFL1连接酶的活性，对其内质网自噬相关的底物进行UFM1修饰。
图2 UFM类泛素化修饰过程
总的来说，Jacob E. Corn研究组的工作通过全基因组CRISPRi为基础的筛选找到了200个与内质网自噬相关的基因，为今后对于内质网自噬相关过程以及相关疾病的研究提供了重要的数据库。同时，作者们发现了一条DDRGK1依赖的、UFM1类泛素化修饰相关的内质网自噬相关信号通路，进一步丰富了关于内质网自噬方面的研究（图3）。
图3 全基因组筛选揭示出内质网自噬分子机制模型图
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.017

参考文献

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