来源：植物科学最前沿
原标题：Nat. Commun. ：一种既增加保真性又提高了靶标位点编辑活性的 SpCas 9 突变体
近日，Nature Communications在线发表了匈牙利科学院自然科学研究中心酶学研究所题为‘Blackjack mutations improve the on-target activities of increased fidelity variants of SpCas9 with 5′G-extended sgRNAs’的研究论文。21G-sgRNAs 的SpCas9核酸酶突变体增加了保真性进一步增强基因编辑的特异性。
5′端延长的sgRNA可影响e-, -HF1, Hypa-, evo-, and HeFSpCas9的保真性的活性，研究人员认为这可能是Glu1007和Tyr1013对sgRNA的5个末端进行覆盖造成的，预计可以通过突变去除覆盖将为sgRNA的5‘端延伸，而不会与多肽链发生冲突，并且可以在不破坏折叠蛋白结构特征的情况下实现，这样的修饰可以将目标空间扩展到非20 个核苷酸长度的目标序列而不会丢失保真性。研究人员提出通过产生突变体干扰蛋白质与5′端RNA的相互作用可以提高核酸酶的保真性。研究人员从高保真核酸酶中选择SpCas9-HF1作为起始平台，通过用甘氨酸取代Glu1007和Tyr1013来产生突变体，并且创造了两个缺失突变体。测试中两个含有缺失的突变体在21G-sgRNAs具有活性，进一步创造16个缺失突变体进行测试，筛选到最佳候选体命名为Blackjack-SpCas9-HF1 (B-SpCas9-HF1)，其氨基酸L1004和K1014之间仅含有两个甘氨酸残基。Blackjack突变使对21G-sgRNAs突变的靶标活性增加了17倍，增加了对靶点的选择。
为进一步研究Blackjack突变引起的目标选择性增加是否也会增加保真度，研究人员用144个sgRNAs对50个目标序列进行检测发现21G-sgRNAs突变增加了所有SpCas9突变体的保真性。为了获得更完整的目标覆盖率并测试研究结论，研究人员创建与eSpCas9和SpCas9-HF1具有相同保真性和目标选择性的Blackjack变体。
本研究中开发的21G-sgRNAs核酸酶中，有三种突变体可以得到普遍应用， eSpCas9-plus、SpCas9- hf1 -plus和BSpCas9分别是eSpCas9，SpCas-HF1，和WTSpCas9的优越突变体。三种突变体提供了更高的保真性编辑能力，目标活性也没有检测到任何程度的下降，并且当20G-sgRNAs作为靶标的难以确定合适序列时该突变体的优势凸显。此外，突变体可能与任何SpCas9或dSpCas9编辑器或表观基因组编辑器结合，以增加编辑的特异性。
本研究中开发的21G-sgRNAs核酸酶中，有三种突变体可以得到普遍应用， eSpCas9-plus、SpCas9- hf1 -plus和BSpCas9分别是eSpCas9，SpCas-HF1，和WTSpCas9的优越突变体。三种突变体提供了更高的保真性编辑能力，目标活性也没有检测到任何程度的下降，并且当20G-sgRNAs作为靶标的难以确定合适序列时该突变体的优势凸显。此外，突变体可能与任何SpCas9或dSpCas9编辑器或表观基因组编辑器结合，以增加编辑的特异性。
原文连接：
https://www.nature.com/articles/s41467-020-15021-5
来源：frontiersin 植物科学最前沿
原文链接：http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIyOTY2NDYyNQ==&mid=2247494381&idx=4&sn=f63ea9132209bf9f144e3878fbbf5915&chksm=e8bd98f3dfca11e503b5be9cf11629bbdc42e9e0d7d01e6c02a6aaf55c57179c2e1c31bf24ae&scene=27#wechat_redirect
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