来源：材料科学前沿
大量研究表明，NO 是重要的生物信使分子参与血管调节、神经传递、炎症与免疫反应等过程 , 其分布广泛 , 遍及脑、血管、免疫、肺、生殖等多种器官，NO 缺乏将导致器官功能失调, 引发各种疾病。在心血管领域，NO是一种血管扩张剂，能促进内皮细胞的生长和迁移，从而促进血管的新生。
因此， NO释放生物材料一直都是研究的重点。韩国延世大学的Hak-Joon Sung教授研究团队使用了一种明胶基NO释放水凝胶，它通过谷氨酰胺转胺酶反应进行交联，将NH3沉积在水凝胶之中，植入后，NH3被部分氧化为NO，从而释放。作者利用NO释放水凝胶研究NO在调节人源间充质细胞（骨髓间充质干细胞BMSCs和脂肪间充质干细胞ADSCs）血管生成机制，发现NO凝胶支持BMSCs出现周细胞样特征，支持ADSCs向内皮细胞分化。
伤口愈合研究也表明，NO凝胶植入后，嵌入的BMSCs呈现出更多的周细胞标志物表达，有助于伤口愈合。该研究成果以题为“Hydrogel cross-linking–programmed release of nitric oxide regulates source-dependent angiogenic behaviors of human mesenchymal stem cell”的论文发表在《SCIENCE ADVANCES》上（见文后原文链接）。文章第一作者为Mi-Lan Kang。
一石二鸟：酶反应沉积NH3并交联明胶研究人员将不同质量的谷氨酰胺转胺酶(mTG)溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，质量体积比分(w/v%)别为2.43%(#1)、4.76%(#2)和9.6%(#3)，接着加入明胶溶液(同样溶于PBS中)，比例为5.5% (w/v)，mTG与明胶的比例始终为9:1 (v:v)。在mTG的作用下，谷氨酰胺的酰胺基团[-(C═O)NH2]与赖氨酸的氨基形成肽键，实现蛋白质交联与NH3沉积。研究人员通过控制交联度[NO凝胶(交联剂重量/总溶液体积%):2.4%(#1)，4.8%(#2)，9.6%(#3)]来改变凝胶的力学强度。图2B显示氨气浓度与mTG用量成正比，其中最高的氨浓度为9.6%(#3)组凝胶。
由于氨也可以通过细胞内多胺底物经mTG催化生成，NO凝胶培养hMSCs后，中的多胺浓度与mTG用量成反比。这也是NO水凝胶存在NO释放的另一个证据。研究人员将骨髓来源和脂肪组织的间充质细胞分别在NO水凝胶上培养发现，2.4%(#1)的水凝胶更支持两种hMSC的体外3D生长和发芽(图1C)，另外，这一结果在“大鼠主动脉环离体培养微血管萌发实验”中也得到证实。
为了验证水凝胶的硬度对于微血管萌发的影响，研究人员平衡了三种凝胶中NO的浓度(在2.4%(#1)和4.8%(#2)的NO凝胶中加入氨，使其达到9.6%(#3)的浓度)，但改变硬度，发现虽然氨的量是相等的，但与其他凝胶相比，2.4%(#1)凝胶中有更多的血管生长。这表明凝胶硬度在调节hMSC的行为如发芽生长方面起关键作用，其中NO凝胶2.4% (#1:~1.5 kPa)的硬度最好。在谷氨酰胺转胺酶的作用下，研究人员成功地得到了具有NO释放能力的NO水凝胶，整个过程简单快捷，高效。
图1所示：NO释放水凝胶的表征。NO释放水凝胶使ADSC有类似于EC的行为和BMSC有类似周细胞的行为研究者为了探究NO释放水凝胶的促进血管生成能力，将P3和P6代的ADSCs和BMSCs在2.4% (#1:~1.5 kPa)NO凝胶上培养14天。虽然ADSCs的P3和P6代都表现出细胞与细胞之间相互作用和成管能力，但在BMSCs的两代上很少被观察到(Fig. 2A-i)。血管生成的相关基因在NO凝胶上的P3和P6代ADSCs都上调表达(相比于种在聚苯乙烯，TCPS上)，然而只有P6代的BMSC(在NO水凝胶上)的血管生成基因的表达量才多于种在TCPS上的P6代的BMSC，P3代的BMSC并非如此(图2 a-ii)。
图1所示：NO释放水凝胶的表征。NO释放水凝胶使ADSC有类似于EC的行为和BMSC有类似周细胞的行为研究者为了探究NO释放水凝胶的促进血管生成能力，将P3和P6代的ADSCs和BMSCs在2.4% (#1:~1.5 kPa)NO凝胶上培养14天。虽然ADSCs的P3和P6代都表现出细胞与细胞之间相互作用和成管能力，但在BMSCs的两代上很少被观察到(Fig. 2A-i)。血管生成的相关基因在NO凝胶上的P3和P6代ADSCs都上调表达(相比于种在聚苯乙烯，TCPS上)，然而只有P6代的BMSC(在NO水凝胶上)的血管生成基因的表达量才多于种在TCPS上的P6代的BMSC，P3代的BMSC并非如此(图2 a-ii)。研究者认为以上结果符合预期，即NO具有促进衰老细胞的体外血管生成能力。因此P6代的细胞被用于后续的研究。在后续的实验中发现，EC标志物PECAM1和Flk1在ADSCs中的蛋白表达明显高于BMSCs中表达(图2B-i)，在Western blotting中(图2B-ii)，结果也同样如此。在NO凝胶培养后的第14天，血管生成素1 (ANGPT1)，一种周细胞介导的血管稳定因子的累积分泌在BMSCs中有更高的水平。这些结果表明，NO凝胶支持BMSCs的周细胞样特征，支持ADSCs向内皮细胞分化。为了确定NO的来源，研究者检测了细胞内的和培养环境中的NO含量水平(因为NO可以被氧化成亚硝酸盐(NO2−)和硝酸盐(NO3−)，所以测定这些阴离子(即总NO浓度)的浓度作为NO产生的证据)。NO凝胶培养14天后，与在TCPS上培养相比，hMSCs的总NO浓度更高(图2C)。
图2所示：体外NO凝胶培养14天，ADSC有类似于内皮细胞的行为和BMSC类似于周细胞的行为。NO释放水凝胶嵌入BMSC促进组织修复研究人员进一步进行了体内伤口愈合试验，探究NO释放水凝胶的作用。图5A显示，在这个创面愈合的体内模型中，嵌入BMSC的NO水凝胶的创面闭合速度更快。同时，与其他组相比，嵌入BMSC的NO水凝胶组胶原纤维形成较早，创面炎症浸润较晚(图5B)。通过定量分析和周细胞标记物(CD146、NG2和desmin)免疫荧光 (图5C)来确定周细胞特征，BMSC的周细胞标记物明显多于ADSC组。结果进一步支持BMSC的周细胞样行为，加速伤口愈合。
图5所示：体内伤口愈合研究。小结NO是重要的气体分子，调节各种生理活动。在科学研究中，研究人员开发出了各种NO前体物质，如diazeniumdiolate等。在本研究中，研究人员另辟蹊径，借鉴NO循环方式，将NH3沉积在明胶之中，同时完成交联，获得NO释放水凝胶，思路巧妙。研究人员选取了种子细胞大热门之二BMSC和ADSC，将其培养在了NO释放水凝胶上。经过一系列实验，得到NO释放水凝胶诱导BMSC呈现周细胞样特征，与之对应，诱导ADSC向EC分化，这也证明NO释放水凝胶是一个优秀的研究NO分子研究平台。研究人员认为尽管NO对血管生成和人源间充质细胞行为的有益影响已被广泛研究，但在方式仍有模糊之处，因此NO释放水凝胶作为阐明人源间充质细胞促进血管生成机制的平台，在生物材料和再生医学领域具有重要价值。
图2所示：体外NO凝胶培养14天，ADSC有类似于内皮细胞的行为和BMSC类似于周细胞的行为。NO释放水凝胶嵌入BMSC促进组织修复研究人员进一步进行了体内伤口愈合试验，探究NO释放水凝胶的作用。图5A显示，在这个创面愈合的体内模型中，嵌入BMSC的NO水凝胶的创面闭合速度更快。同时，与其他组相比，嵌入BMSC的NO水凝胶组胶原纤维形成较早，创面炎症浸润较晚(图5B)。通过定量分析和周细胞标记物(CD146、NG2和desmin)免疫荧光 (图5C)来确定周细胞特征，BMSC的周细胞标记物明显多于ADSC组。结果进一步支持BMSC的周细胞样行为，加速伤口愈合。图5所示：体内伤口愈合研究。小结NO是重要的气体分子，调节各种生理活动。在科学研究中，研究人员开发出了各种NO前体物质，如diazeniumdiolate等。在本研究中，研究人员另辟蹊径，借鉴NO循环方式，将NH3沉积在明胶之中，同时完成交联，获得NO释放水凝胶，思路巧妙。研究人员选取了种子细胞大热门之二BMSC和ADSC，将其培养在了NO释放水凝胶上。经过一系列实验，得到NO释放水凝胶诱导BMSC呈现周细胞样特征，与之对应，诱导ADSC向EC分化，这也证明NO释放水凝胶是一个优秀的研究NO分子研究平台。研究人员认为尽管NO对血管生成和人源间充质细胞行为的有益影响已被广泛研究，但在方式仍有模糊之处，因此NO释放水凝胶作为阐明人源间充质细胞促进血管生成机制的平台，在生物材料和再生医学领域具有重要价值。全文链接：https://advances.sciencemag.org/content/6/9/eaay5413
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