王幼平团队利用CRISPR/Cas9单碱基编辑系统创制抗除草剂甘蓝型油菜新种质！

来源：植物科学最前沿

原标题：PBJ：扬州大学王幼平团队利用CRISPR/Cas9单碱基编辑系统创制抗除草剂甘蓝型油菜新种质！

杂草危害可使我国油菜籽产量下降15.8%，严重的田块减产幅度可达50%以上。培育抗除草剂油菜新品种是增加油菜产量、实现油菜规模化种植的重要举措。2016年科学家们陆续发展出了单碱基编辑技术，该技术将胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶与nCas9或dCas9融合，在与sgRNA互补配对的靶位点特定区域实现单碱基C-T（G-A）或者A-G（T-C）的精准替换。目前基于CRISPR/Cas9的碱基编辑器已被成功用于多种植物，包括拟南芥、水稻、玉米、小麦和棉花等。但是目前还没有碱基编辑技术被应用于油菜的报道。

2020年2月24日，Plant Biotechnology Journal在线发表了扬州大学王幼平教授团队题为“Engineering herbicide-resistant oilseed rape by CRISPR/Cas9-mediated cytosine base-editing”的研究论文。该研究首次报道在油菜中实现单碱基编辑，并成功对乙酰乳酸合成酶基因（ALS）进行编辑，创制出抗苯磺隆除草剂的油菜新种质。

ALS是植物和微生物中3种支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）生物合成的关键酶。喷施ALS类除草剂可使植物体内ALS活力降低，导致3种支链氨基酸合成受阻，植株生长受抑。已知ALS的某些氨基酸残基的改变可以引起植物对ALS类除草剂的敏感性下降，从而产生对ALS类除草剂的抗（耐）性。

异源四倍体甘蓝型油菜中共5个拷贝的ALS基因。通过转录组分析发现只有BnALS1和BnALS3组成型表达，且两者高度同源，与拟南芥AtALS氨基酸同源性达92.8%，是创制抗除草剂油菜的理想编辑靶点。研究人员在pCAMBIA1300载体骨架基础上，利用水稻碱基编辑载体pH-nCas9-PBE中的rAPOBEC1-nCas9-UGI元件，改造构建了适合于油菜等双子叶植物的胞嘧啶碱基编辑载体。利用该碱基编辑系统成功对BnALS1基因Pro197进行靶向突变，共获得BnALS1基因P197F和P197S两种类型的突变体，碱基编辑效率为1.8%。上述突变体可稳定遗传，并在T1代即可获得剔除T-DNA的纯合突变材料。分别对野生型（转基因受体材料）、纯合突变体和杂合突变体喷施2.5、5、10、15、30 mg ai/L的苯磺隆，发现野生型植株在2.5mg ai/L的浓度下就受到严重药害，而 P197S纯合突变体和杂合突变体分别在15 和10 mg ai/L（3倍田间推荐喷施剂量）的浓度下均未表现任何药害症状，且纯合突变体在30 mg ai/L剂量下仍然能存活。该研究还开发了该抗除草剂位点的特异功能分子标记，可用于油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。

扬州大学吴健博士为该论文的第一作者，王幼平教授和上海师范大学张辉教授为共同通讯作者。该研究得到的国家重点研发项目和转基因重大专项的资助。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13368