Dev Cell ：余谦慧等在单细胞水平揭示肺部芽尖祖细胞的发育分化

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基底干细胞是肺部等多种器官的上皮干细胞。在维持器官组织稳态、损伤修复等方面发挥重要作用。其失调与肺部纤维化等疾病密切相关。若能高效地通过体外诱导培养的方式获得功能良好的基底干细胞，将有可能将其用于肺部损伤修复、相关疾病的细胞疗法等方面。而要建立有效的基底干细胞的体外诱导技术，很重要的一点就是要阐明人体发育过程中分化产生该细胞类型的分子机制。以往的报道表明，肺部的基底干细胞在小鼠及人体胚胎中能由肺部的芽尖祖细胞分化产生。但由于伦理问题，能用于研究的人体胚体组织有限，研究者依然缺少对该分化过程分子机制的深入了解。

2020年2月27日，美国密西根大学Jason R. Spence课题组与瑞士巴塞尔分子与临床眼科研究所J. Gray Camp课题组，瑞士苏黎世联邦理工大学Barbara Treutlein课题组合作（Alyssa J. Miller与Qianhui Yu（余谦慧）为该研究共同第一作者）在Developmental Cell杂志上发表文章In vitro and in vivo development of the human airway atsingle-cell resolution，以体外培养的人类胚胎肺部芽尖祖细胞为模型，鉴定出体外诱导产生类基底干细胞的关键分子，并以单细胞转录组测序、蛋白染色及体外分化为手段，证明体外诱导获得的基底干细胞在转录组分子特征与细胞分化多样性上与体内的基底干细胞的高度相似性。

该研究首先以从11至13周人类胚胎分离得到的肺部芽尖祖细胞为体外模型，在培养液中分别加入已知与肺发育分化相关的信号通路因子。实时定量PCR与蛋白染色结果结果显示，在培养液中加入同时加入SMAD信号通路激活因子TGFb1与BMP4，经过三天的处理，能极大地提高基底干细胞分子标记物TP63转录本的含量。

激活SMAD信号通路能诱导TP63表达量实际上是令人意外的，因为以前的研究表明在体外维持来自成年人成熟的基底干细胞需要抑制SMAD信号通路。在人体胚胎肺部不同部位对基底干细胞分子标记物的蛋白染色结果也显示，共表达KRT5和TP63的成熟的基底干细胞中SMAD信号通路标记物（如pSMAD2）含量较低，从而暗示要想获得成熟的基底干细胞，SMAD信号通路的活性不能太高。

实时定量PCR结果表明， TP63在先后经过SMAD激活与抑制处理得到的细胞培养物中表达量最高。为了更全面地了解体外诱导获得的细胞与体内细胞在转录组水平上的相似程度，该研究对11.5周至21周胚胎的肺部端部、小气管以及气管进行单细胞转录组测序，构建了人类胚胎期肺部不同区域各细胞类型的转录组图谱，鉴定了芽尖祖细胞与基底干细胞等12种表皮细胞的分子标记物。

以此为基础，将体外诱导不同阶段的细胞群体与体内细胞类型进行比对，证实了经过3天SMAD通路激活处理的细胞群体虽然总体仍与芽尖祖细胞类似，但已经开始分化，部分细胞中能检测到基底干细胞分子标记物TP63的转录本。

而经过了进一步的18天的SMAD通路抑制处理得到的细胞群体已经呈现明显的异质性。部分细胞与基底干细胞在转录组水平上非常相似，称为类基底干细胞。以细胞表面蛋白EGFR与F3为标记物，通过流式细胞仪分选获得的单个类基底干细胞在体外培养中能分化为多种细胞类型，分别表达棒状细胞（club cell，SCGB1A1+）、纤毛细胞（ciliated cell, FOXJ1+），肺部杯细胞（goblet cell, MUC5AC+）的分子标记物，证实了体外诱导获得的类基底干细胞具有多能分化性，与体内的基底干细胞相一致。

综上所述，该研究建立了体外筛选鉴定细胞分化决定因子的研究框架，鉴定了SMAD信号通路在肺部基底干细胞在人类胚胎肺部发育分化过程中的关键作用，建立了体外诱导获得分子学与细胞学上与体内基底干细胞高度相似的类基底干细胞的实验方法，这将有助于推动肺部再生医学的发展。同时该研究提供了人类胚胎肺部各区域的单细胞转录图谱，这也将为日后进一步改进诱导方法，以及研究其他细胞类型的发育分化提供重要的体内参照。