NCB ：鉴定新母源性因子诱导小鼠胚胎干细胞向类二倍体胚胎细胞分化

来源：BioArt

在胚胎发育过程中关键一步是在配子细胞（精子和卵子）结合后，母源性因子引发促进表观特异性修饰的配子基因组进行表观重编并形成具有全能干性 (Totipotency) 的合子细胞 (Zygote)，此过程被称为合子基因激活 (Zygotic gene activation, ZGA) 。在小鼠胚胎发育过程中，合子基因激活在二倍体细胞 (2-Cell, 2C）发育阶段达到高峰，并呈现特异性基因表达谱，比如特异性高表达Zscan4, Dux基因和MERVL内源性逆转录病毒。

因此鉴定能引发胚胎发育早期合子基因激活过程的母源性因子对理解全能干性具有重要意义。早期研究认为全能干性只存在于体内胚胎发育早期分裂期胚胎，而近年来研究发现体外培养的小鼠胚胎干细胞 (mESC）是亚稳态的，其中非常少的一部分细胞可以自发获得类二倍体细胞 (2C-like）特征，包括基因表达及表观修饰谱（染色质开放性图谱）和全能干性。由于一个胚胎只能收获两个二倍体细胞，体内研究受到细胞数量的限制；这一发现为研究合子基因激活过程和全能干性的分子调控机理提供了新思路。

近年来已有不同实验室成功诱导体外培养的小鼠胚胎干细胞向类二倍体细胞转化，比如过表达Dux （专家点评Nature Genetics | 张毅团队证明体内DUX并非小鼠胚胎基因组激活的关键因子；Cell Research丨高绍荣团队全面描绘DUX在小鼠胚胎基因组激活中的作用）和抑制CAF-1的表达。

近日，新加坡A*STAR（Agency for Science, Technology and Research）的Wee-Wei Tee团队在Nature Cell Biology杂志上发表文章Maternal factor NELFA drives a 2C-like state in mouse embryonic stem cells，发现转录延伸抑制复合物组分之NELFA通过与Top2a互作介导Dux的表达和诱导小鼠胚胎干细胞向类二倍体细胞转化。

此课题目的是寻找能实现体外诱导小鼠胚胎干细胞向类二倍体细胞转化的母源性因子。研究人员首先从GEO数据库中下载了小鼠胚胎植入前各个发育阶段的RNA-seq转录组数据。此数据包括卵母细胞, 合子，早二倍体细胞，晚二倍体细胞, 四倍体细胞, 八倍体细胞，和胚胎干细胞的基因表达数据。对其进行基因聚类分析发现一组基因(2072个) 在卵母细胞, 合子和二倍体细胞发育阶段高表达，随后其表达水平随着发育而降低。

进一步分析发现在此2072个基因中，只有8个基因在其它不同方法诱导而来的类二倍体胚胎细胞中表达也被显著上调。最终研究人员选取了NELFA作为进一步研究对象，因为其经典功能是作为转录延伸抑制复合物 (Negative elongation factor，NELF）中的一个组分，但其他因子 (NELFB，NELFCD 和NELFE) 却并没有像NELFA一样在胚胎发育前期高表达。

通过一系列免疫荧光染色发现，在体外培养的小鼠胚胎干细胞中, 虽然绝大部分胚胎干细胞不表达NELFA 但高表达胚胎干细胞标志物Oct4，有极少一部分细胞（~0.1-0.3%）高表达NELFA但并不表达Oct4；NELF复合物其它组分因子表达水平则没有区别。这提示了NELFA同全能干性的关系是独立于NELF复合物的，这一假设通过一序列功能缺失实验得到验证。通过分别向小鼠晚桑椹胚注射NELFA高表达和低表达的细胞并对其在嵌合体囊胚进行荧光追踪，发现高表达细胞能进入胚胎内细胞团和胚胎外滋养层而低表达细胞只能分布于胚胎内细胞团，证明NELFA高表达细胞具有全能干性。

通过RNA-seq分析，研究人员发现NELFA高表达的胚胎干细胞（流式分选），其调控的靶基因组和二倍体细胞相似而与胚胎干细胞迥异。进一步研究发现，NELFA不仅能作为全能干细胞标记物，其本身诱导胚胎干细胞向胚胎类二倍体细胞转化, 通过对比分析诱导前后的RNA-seq和ATAC-seq的数据，发现NELFA能特异性上调类二倍体细胞基因表达谱，并且NELFA诱导的细胞其全基因组染色质开放性图谱和类二倍体细胞相似并与胚胎干细胞迥异。对其促转化机制的研究发现，NELFA是通过上调Dux表达水平而上调类二倍体细胞转录谱的。蛋白质谱筛查发现Top2a只与NELFA存在特异性结合，随后功能缺失分析证实Top2a参与NELFA介导的Dux表达上调和全能干性的诱导。

通过整合对比分析胚胎干细胞和不同手段诱导的类二倍体细胞RNA-seq数据发现糖酵解通路（Glycolysis）表达水平/活性都有不同程度的下调，而以往研究发现糖酵解通路的抑制对全能干性有重要意义。进一步通过化学抑制糖酵解通路后，通过对RNA-seq 和ATAC-seq数据分析和进行小鼠胚胎注射进行发育潜能功能性实验验证后，证实了抑制糖酵解通路能显著促进胚胎干细胞向类二倍体细胞转化。另外研究人员还进一步发现全能干性和多能干性不能在细胞中并存。通过特殊培养基使胚胎干细胞保持其多能干性能显著抑制胚胎干细胞向类二倍体细胞转化。

总之，该研究发现母源性因子NELFA 诱导小鼠胚胎干细胞向类二倍体细胞转化，以及伴随着细胞潜能转变的代谢水平变化。另外该研究证明通过小分子操纵代谢通路可以有效促进细胞潜能性改变，这为研究全能干性的分子机制和细胞潜能重编提供了新方法。