何川/周翔/张强锋合作开发转录组水平RNA二级结构测定的新技术Keth-seq

来源：BioArt

原标题：Nat Chem Biol：何川/周翔/张强锋合作开发转录组水平RNA二级结构测定的新技术Keth-seq

RNA分子除了作为遗传信息的传递者，还参与到多种不同的生物学过程中。RNA在从产生到降解的过程中，其结构对于行使特定功能非常重要。比如，RNA分子通过一定结构与RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）结合形成核酶（ribozyme），在RNA剪切（splicing）、翻译（translation）等过程中起催化作用【1】；还有的RNA在面对不同的细胞环境或者与不同的离子结合时，能够通过改变结构而调节基因的表达水平【2，3】。因此，研究RNA的二级结构能够更好的理解其功能。

随着研究的深入和技术的进展，RNA结构的测定已经从单个RNA水平进入到整个转录组水平的高通量研究【4】，从in vitro的模型研究转变为in vivo实时动态的结构监测。传统的技术如X-ray、NMR、cryo-EM、计算机模拟等难以满足需要，而最近几年发展起来的结合化学小分子探针的测序技术在高通量及in vivo研究中越来越体现出独特的优势。这类方法通过化学小分子探针修饰RNA碱基以引入逆转录停止（Reverse Transcription stop, RT stop）或者突变（mutation），从而得到RNA碱基所处的单双链状态（即RNA分子的二级结构信息）【4】。目前可以用于in vivo的RNA二级结构高通量测序技术的小分子主要有DMS（DMS-seq【5】、Structure-seq【6】）和SHAPE分子（icSHAPE【7】）两类。这些新技术虽然已用于不同的研究中，但是仍然具有一定的局限性。DMS分子在浓度较高时具有细胞毒性，且大部分是对碱基的Hoogsteen face进行甲基化；SHAPE分子修饰的是碱基的糖环部分，易水解而不稳定【8】。因此，特异性更强、毒性更低、更高效稳定的化学分子是提升RNA二级结构测序技术的关键。

2020年2月3日，来自芝加哥大学的何川教授团队联合武汉大学周翔教授团队、清华大学张强锋教授团队在Nature Chemical Biology上在线发表了题为Keth-seq for transcriptome-wide RNA structure mapping的工作。该研究使用的N3-Kethoxal分子【图1a】，能够特异地和单链状态的鸟嘌呤（G）反应【图1b】，在逆转录时通过引入修饰碱基的停止信号，在测序后得到RNA in vivo状态的二级结构信息，并且通过富集显著增强修饰信号【图1c】。N3-Kethoxal分子具有很好的细胞渗透性，加入细胞培养基后5分钟左右RNA的标记即可达到饱和（图1d），具有比其他分子更快的修饰效果【8】。此外，该分子的修饰在95 ˚C加热后能被去除【图1e】。

图1：N3-kethoxal分子及其特性

Keth-seq作为在全转录组鉴定RNA二级结构的新方法，具有较高的特异性，其修饰碱基中鸟嘌呤的比例远远高于其他碱基且在重复样本之间具有高度的一致性【图2a】。与已知的其他技术比如icSHAPE相比，两者在整体检测到的鸟嘌呤的结构信号分布上具有很高的相关性【图2b】。在一些已知结构的RNA上，Keth-seq检测到的结构信号与真实结构更加吻合【图2c】。在与DMS-seq的比较中，Keth-seq也达到了相似的检测准确性水平【8】。因此，Keth-seq作为一个新方法，其结构检测的准确性可以达到或者超过当前的类似技术。

图2：Keth-seq及在rG4区域附近的信号

Keth-seq特异检测鸟嘌呤结构信号的特点可用于RNA G-四链体（RNA G-quadruplexes，rG4）的探测。之前的研究发现rG4结构广泛的存在于体外（in vitro）哺乳动物RNA中。rG4在加入PDS的条件下更加稳定，但是在体内（in vivo）条件下rG4存在与否存在争议【9，10】。作者首先比较了in vitro条件下，+PDS样本和-PDS样本在已知的in vitro rG4区域的结构。发现在+PDS样本中，这些区域的基尼系数（GINI index，值越大，结构值分布越不均匀，结构越多）更大，具有更多的结构【图2d】。同样的，在in vivo条件下，这些已知的rG4区域在+PDS样本也是具有更多的结构，表明它们在in vivo条件下也可能形成rG4结构【图2d，2e】。 

综上所述，Keth-seq采用的分子具有更高的特异性和修饰效率，在结构探测上得到了和其他技术类似水平或者更好的效果。特异性的鸟嘌呤修饰使得该技术可用于G富集的序列的结构测定，比如不同条件下的rG4结构等。 

据悉，芝加哥大学的何川教授、武汉大学周翔教授和清华大学张强锋教授为本文的通讯作者，武汉大学翁小成教授、清华大学博士生龚警、武汉大学博士生陈毅、芝加哥大学博士生吴桐为本文共同第一作者。 

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41589-019-0459-3

参考文献

1. Kruger K, Grabowski PJ, Zaug AJ, Sands J, Gottschling DE, Cech TR.Self-splicing RNA:501 autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNAintervening sequence of 502 Tetrahymena. Cell 1982;31:147–57.

2. Nahvi A, Sudarsan N, Ebert MS, Zou X, Brown KL, Breaker RR. Geneticcontrol by a 507 metabolite binding mRNA. Chem Biol 2002;9:1043.

3. Mandal M, Breaker RR. Gene regulation by riboswitches. Nat Rev MolCell Biol 509 2004;5:451–63.

4. Meiling Piao, Lei Sun, Qiangfeng Cliff Zhang. RNA Regulations andFunctions Decoded by Transcriptome-wide RNA Structure Probing. GenomicsProteomics Bioinformatics  2017;15(5):267-278

5. Rouskin S, Zubradt M, Washietl S, Kellis M, Weissman JS. Genome-wideprobing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.Nature  2014;505:701–5.

6. Ding Y, Tang Y, Kwok CK, Zhang Y, Bevilacqua PC, Assmann SM. In vivogenome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatoryfeatures. Nature 2014;505:696-700

7. Spitale RC, Flynn RA, Zhang QC, Crisalli P, Lee B, Jung JW, et al.Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature 2015;519:486–90.

8. Xiaocheng Weng, Jing Gong, Yi Chen, Tong Wu, Fang Wang, Shixi Yang, etal. Keth-seq for transcriptome-wide RNA structure mapping. Nature ChemicalBiology 2020

9. Kwok CK, Marsico G, Sahakyan AB, Chambers VS, Balasubramanian S.rG4-seq reveals widespread formation of G-quadruplex structures in the humantranscriptome. Nature methods 2016;13(10):841.

10. Guo JU, Bartel DP. RNA G-quadruplexes are globally unfolded ineukaryotic cells and depleted in bacteria. Science 2016;353(6306):aaf5371.