DNA-PK激活STING非依赖的DNA识别通路

来源：BioArt

撰文 | 小飞飞

cGAS (cyclic GMP-AMP synthase)–STING (stimulator of interferon genes) 通路在机体中能感受细胞中异常存在的DNA（包括病原体感染带来的外源DNA和自身来源的内源DNA），进而激活I型干扰素产生，对机体抗病毒免疫，抗肿瘤免疫以及一些自身免疫病的发生都有重要作用。cGAS识别双链DNA (dsDNA)后活化，催化产生环化二嘌呤核苷（cyclic guanosine monophosphate–adenosine monophosphate，cGAMP)，cGAMP作为第二信使特异性结合内质网上STING，STING活化形成聚合体，转移至细胞核附近的高尔基体，招募丝氨酸苏氨酸蛋白激酶TBK1（tank-binding kinase 1），进而使得转录因子IRF3（interferon regulatory factor 3）磷酸化并激活入核，诱导I型干扰素的表达启动干扰素免疫反应【1,2】。同时除了cGAS，也有文献报道其他的DNA感受器的存在，但这些感受器都被认为是作用于STING的上游【3】。是否存在其他STING非依赖的DNA识别通路仍然未知。

近日，来自美国University of Washington School of Medicine的Daniel B. Stetson教授团队在Science Immunology上发表题为Human DNA-PK activates a STING-independent DNA sensing pathway的文章，从人腺病毒5（human adenovirus 5）的原癌基因E1A入手，发现E1A在人细胞中可以阻断经典的cGAS-STING DNA识别通路，同时还可以阻断STING非依赖的DNA识别通路（STING-independent DNA sensing pathway，SIDSP)，且DNA依赖的蛋白激酶DNA-PK（DNA-dependent protein kinase)是SIDSP的DNA感受器，热休克蛋白HSPA8是SIDSP的下游靶标。

Daniel B. Stetson教授团队之前曾报道，DNA肿瘤病毒(DNA tumor virus)的病毒原癌基因是cGAS-STING DNA识别通路的强有力拮抗剂【4】，为研究其中机制，研究团队关注在HEK 293细胞系中组成性表达的E1A，发现E1A不影响RIG-1通路激活引起的I型IFN反应，但可阻断小牛胸腺DNA（calf thymus DNA，CT DNA）对I型IFN反应的激活，CRISPR介导的E1A敲除可以恢复HEK 293中DNA激活的I型IFN反应（图1A）。在E1A表达的对照HEK 293细胞中，尽管CT DNA转染可以激活TBK1的S172位磷酸化，但和RIG-1通路激活的IRF3 S396位磷酸化相比，IRF3 S396磷酸化明显降低，E1A的敲除可以恢复DNA激活的IRF3 S396位磷酸化（图1B），表明E1A对IRF3激活的阻断发生在TBK1激活和IRF3磷酸化之间。进一步研究团队构建STING KO和TBK1 KO HEK 293细胞系，发现cGAMP诱导的IRF3活化是依赖于STING和TBK1的。同时出乎意料的，DNA激活的IRF3 S396磷酸化在STING和TBK1敲除细胞中依旧存在（图1C）。E1A的敲除可以恢复STING依赖以及STING非依赖的IRF3 S396位磷酸化（图1D）。这些数据表明，HEK 293中存在STING依赖的以及STING非依赖的DNA识别通路，且E1A可以阻断这两种通路的激活。

图1 E1A可阻断HEK 293中STING依赖的以及非依赖的DNA识别通路

随后，研究团队对两种通路进行更详细的研究。发现在小鼠细胞中，CT DNA转染引起的I型IFN激活主要是依赖于STING的。在人U937单核细胞系中构建STING KO的两株细胞系，发现STING KO的U937丧失对cGAMP的响应激活，但STING KO并不影响CT DNA转染引起的I型IFN反应。在人永生化的成纤维细胞系中研究团队也证明了STING非依赖的DNA识别通路的存在。进一步研究激活SIDSP通路的DNA配体结构特征，研究人员发现SIDSP通路识别DNA末端结构。考虑到DNA损失修复通路（ATM和DNA-PK通路）能被暴露的DNA末端识别，因此研究团队研究CT DNA激活的SIDSP是否依赖这两种通路的激活，发现SIDSP可以被DNA-PK抑制剂阻断而ATM抑制剂对其没有影响，而STING/DNA-PK DKO细胞系中DNA激活的I型IFN反应明显减弱。同时在人原代肝细胞中，研究人员也证明了SIDSP是其主要的DNA识别通路。

同时在研究DNA转染引起的IRF3 S386位磷酸化的蛋白免疫印迹实验中，研究团队发现IRF3 S386位磷酸化抗体也可识别一个比IRF3大20 kDa左右的“神秘蛋白”（Mystery Protein，MP），MP能响应DNA的转染而不响应RIG-I通路激活和cGAMP刺激，同时DNA激活的MP磷酸化不依赖于STING和TBK1，MP磷酸化对DNA末端有响应（图2）。通过IRF3 pS386 antibody免疫共沉淀以及质谱等，发现热休克蛋白A8（HSPA8）符合MP特征，随后系列的生化实验进一步证明了HSPA8就是MP，且HSPA8 S638磷酸化是DNA-PK SIDSP的下游靶标。随后实验发现，DNA-PK SIDSP在人，灵长类以及大鼠细胞中都存在，但在小鼠细胞中是缺失的。此外，DNA损伤引起的DNA-PK激活并不会引起IRF3和HSPA8的磷酸化激活，表明SIDSP激活引起的DNA-PK活化的下游靶标和DNA损伤激活的的靶标是不一样的。

图2 HSPA8是DNA-PK-SIDSP下游靶标

总之，本篇文章证明了人细胞中存在一条不同于cGAS-STING通路的DNA识别通路，其不依赖于STING，DNA-PK是SIDSP的感受器，HSPA8其下游靶标。对SIDSP的研究将会进一步加深人们对抗病毒固有免疫，抗肿瘤免疫以及自身免疫病发生的理解。

原文链接：

https://immunology.sciencemag.org/content/5/43/eaba4219

参考文献

1. L. Sun, J. Wu, F. Du, X. Chen, Z. J. Chen, Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway. Science 339, 786–791 (2013).

2. J. Wu, L. Sun, X. Chen, F. Du, H. Shi, C. Chen, Z. J. Chen, Cyclic GMP-AMP is an endogenous second messenger in innate immune signaling by cytosolic DNA. Science 339, 826–830 (2013)

3. L. Unterholzner, The interferon response to intracellular DNA: Why so many receptors? Immunobiology 218, 1312–1321 (2013).

4. L. Lau, E. E. Gray, R. L. Brunette, D. B. Stetson, DNA tumor virus oncogenes antagonize the cGAS-STING DNA-sensing pathway. Science 350, 568–571 (2015).