植物单碱基编辑技术成功实现水稻内源基因人工定向进化，掀开农作物育种新篇章

来源：植物科学最前沿

2020年1月28日，中国农业科学院植物保护研究所周焕斌团队在国际著名植物学期刊Molecular Plant上在线发表了题为“Base-Editing-Mediated Artificial Evolution of OsALS1 in planta to Develop Novel Herbicide-Tolerant Rice Germplasms”的研究论文。本研究提出了将单碱基编辑技术应用于植物内源基因定向进化的理念，通过合用两类单碱基编辑器，以及针对靶基因的sgRNA库，在水稻中对除草剂内源靶标基因OsALS1实现近似饱和突变，从而成功发掘出OsALS1抗除草剂新位点，创制出具有除草剂抗性的新种质；进一步通过精准编辑，将该性状快速导入到水稻生产品种中。

https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.01.010

在漫长的人类历史长河中，多种植物的驯化，使得人类步入农耕文明。在人类定向选择下，野生植物中偶然出现的优良性状逐渐留传，最终培育成现代作物品种。在这个过程中，植物中多个关键性状控制基因的变异起着决定性作用。总得来说，农作物遗传变异资源是农作物改良的基石，是保障粮食安全和农业科技创新的战略资源。

一个优良基因能够改变一个产业，甚至引起一场农业革命。当今，大量优良农作物基因（如小麦矮杆基因Rht、水稻矮杆基因sd-1、玉米单倍体诱导基因MTL以及各农作物抗除草剂基因等）已经大规模应用到现代农作物育种和生产中。然而，现代农业中，品种单一化现象日益突出，导致栽培农作物失去了大量的遗传资源，群体内遗传多样性大大降低，存在潜在的生物和非生物性侵害危机。虑此，世界各国逐渐重视种质资源的收集保存与开发利用，已建成多个种质资源繁多的国家种质库。

然而，基因的自然变异速率慢，有的可能需要数万年的时间，无法满足当今人类社会发展的粮食需求。有鉴于此，中国农业科学院植物保护研究所周焕斌团队在前期开发的一系列水稻胞嘧啶单碱基编辑器（Ren et al., Sci. China Life Sci., 2017; Ren et al., Mol. Plant, 2018; Ren et al., Mol. Plant, 2019; Wang et al., Plant Biotech. J., 2020）和腺嘌呤单碱基编辑器（Yan et al., Mol. Plant, 2018; Ren et al., Mol. Plant, 2019; Wang et al., Plant Biotech. J., 2020）基础之上，创新性地提出了单碱基编辑技术介导的水稻内源靶标基因的定向进化技术理念（BEMGE/ben-ji/），在水稻细胞内人工模拟自然界基因的长期进化过程，短时间内创制成千上万个靶基因的新等位基因材料，用于育种筛选。后期利用在目的材料中分离到的碱基编辑器和sgRNA信息，快速地将感兴趣的功能变异位点导入到生产品种中，进行品种的快速升级换代。借助BEMGE，从新等位基因创制到实际生产应用，整个育种过程缩短至2-3年。

Figure 1. The Procedure for Base-Editing-Mediated Gene Evolution of OsALS1 in planta.  
(A) A tiled sgRNA library designed to target the coding sequence of OsALS1. It’s divided into 6 pools of 10-11 sgRNAs according to the target region, each sgRNA pool was cloned into rBE9 and rBE14 vectors, respectively, and then mixed in an equal amount for transformation. The sgRNA pools are shown in different color.

 (B) Schematic diagram of genetic screen for developing novel herbicidetolerant rice germplasms. Six pools of rBE/sgRNA were delivered into rice cells through  Agrobacterium- and particle bombardment-mediated transformation, respectively. Rice calli were selected on plates with both Hygromycin and Bispyribac-sodium,and the regenerated plants from BS-tolerant calli were genotyped by Sanger  sequencing of the endogenous OsALS1 gene and sgRNA transgenes.

在该研究中，研究人员根据BEMGE原理，针对水稻除草剂靶标基因OsALS1全长编码区，设计了63条sgRNA进行覆盖，通过基因枪转化和农杆菌转化的方式将sgRNA库和水稻胞嘧啶单碱基编辑器rBE9以及腺嘌呤单碱基编辑器rBE14同时转入水稻细胞中。对转化细胞群体携带的OsALS1靶标区域进行深度测序，结果表明BEMGE方法成功创制了大量的OsALS1靶基因变异。进一步通过抗除草剂筛选，研究人员成功的鉴定出4个自然界中未曾被发现的、对除草剂具有不同抗性程度的新等位基因；并进一步通过单碱基编辑器介导的精准编辑技术，成功地将变异位点P171F引入到了水稻生产品种南粳46中，由此南粳46升级为“洁田稻”。

BEMGE的提出和在水稻上的成功应用，预示了人类将来可对各农作物各关键性状重要控制基因或其调控序列进行快速定向进化，可发掘出靶标基因的一系列的强、中、弱等位基因。由此，各农作物的各大农艺性状，如株高、株型、叶形、营养吸收、籽粒蛋白质含量、抗逆与发育平衡等，均可以进行精准定制，掀开了农作物精准分子育种的新篇章。另外，BEMGE技术的应用，亦可推动现代分子生物学基因功能的研究，帮助人们更加深入了解基因功能和蛋白调控的奥秘，并可进一步运用到分子育种之中，现代基因功能基础研究和传统农作物育种应用由此被有机地整合到一起。

中国农业科学院植物保护研究所周焕斌课题组博士生旷永洁和中国农业大学生物学院李少芳副教授为共同第一作者，周焕斌研究员为通讯作者，团队多名成员共同合作完成，中国农业科学院植物保护研究所周雪平教授和李香菊研究员、挪威生物经济研究所Carl Spetz研究员也参与此研究工作。本研究工作得到了中国国家自然科学基金、中国农科院科技创新工程以及中国农业大学科研启动经费等项目的支持。