Sci Adv ： 安进亚洲研发中心首次研究出G蛋白偶联受体抗体激动剂

来源：BioArt

G 蛋白偶联受体 (G protein-coupled receptors, GPCRs）在许多正常的生理或病理过程中起关键的作用，它是一类非常重要的药物靶点。迄今为止，大约有三分之一获美国FDA批准的药物靶向G蛋白偶联受体。但是这些药物绝大多数是小分子药物或多肽药物。到目前为止，只有两个生物药靶向G蛋白偶联受体。一个是安进公司（Amgen Inc.）研发的降钙素基因相关肽受体 （Calcitonin gene-related peptide receptor, CGRPR） 抗体拮抗剂Erenumab （商品名为 Amovig）, 用于预防偏头痛。另一个是日本的Kyowa公司研发的抗趋化因子受体4 （chemokine receptor 4，CCR4)）的无岩藻糖基化单克隆抗体Mogamulizumab (商品名为 Poteligeo），用于治疗成人T细胞白血病和外周血T淋巴细胞肿瘤。

针对G 蛋白偶联受体的抗体研发非常具有挑战性。首先是G 蛋白偶联受体具有较差的热稳定性和高度的构象柔韧性，这使得从技术上很难获得纯化的天然受体蛋白。其次是G 蛋白偶联受体的细胞外面部分很小，加上G 蛋白偶联受体种属之间非常保守，使得G蛋白偶联受体的免疫原性和抗原性很弱。这对于A类G 蛋白偶联受体（Class A GPCRs）尤为突出。A类G 蛋白偶联受体对于药物发现而言是最重要的GPCR家族之一，但与具有较大N末端结构域的B类G 蛋白偶联受体 (Class B GPCRs) 不同，大多数A类GPCR具有较短的N末端，这使其免疫原性和抗原性更弱。用高表达靶点蛋白的细胞进行免疫，可能筛选到结合抗体（binders），幸运的话，能得到具有功能的抗体拮抗剂（antagonists），但到目前为止，还没有GPCR抗体激动剂（agonists）的报道。

2020年1月15日，安进亚洲研发中心的抗体研发团队与结构生物学研究团队联合在Science Advances杂志上发表了题为 ”Structure-guided discovery of a single domain antibody agonist against human apelin receptor”的文章，报道了首个G 蛋白偶联受体抗体激动剂，即骆驼单域抗体突变体JN241-9。骆驼单域抗体通常具有相对较长的CDR3区域，适合于结合凹陷的表位结构。G 蛋白偶联受体的配体结合位点通常是这类“口袋型”的结构。具有较长的CDR3的抗体在模拟配体激活G 蛋白偶联受体方面可能具有优势。人 apelin受体APJ属于A类G 蛋白偶联受体。APJ和它的内源性配体，apelin 和apela，在心血管系统中普遍表达，与心血管功能和疾病相关。长效的激活APJ受体的抗体激动剂有可能用于治疗慢性心脏衰竭。

本文章的研究人员将纯化的APJ受体蛋白组装成纳米碟 (nanodiscs)免疫骆驼，然后从免疫骆驼的单域抗体库中用噬菌体展示技术将APJ特异的单域抗体分离出来。通过功能鉴定，研究人员发现绝大部分抗体为很强的抗体拮抗剂，与自然配体竞争结合受体，其余抗体仅为结合抗体，不具有抑制或激活受体的功能。于是研究人员将其中的一个具有竞争拮抗功能的骆驼单域抗体JN241与APJ受体共结晶，并解析了晶体结构。这也是首个报道的G 蛋白偶联受体与功能抗体的共结晶结构。JN241序列中有较长的CDR3（23 氨基酸）区域。研究人员发现这个长的CDR3区域深插到受体的配体结合凹陷表位，抗体的其它区域则与受体的膜外部分结合，阻断配体的结合。

研究人员进一步比较了APJ/JN241 共结晶结构与APJ/配体类似物的共结晶结果，发现JN241 CDR3在结合方式上与配体的结合非常相似，只是缺乏与疏水核 （hydrophobic core） 的互作。于是研究人员设计了九个JN241突变体，将带有芳香环的氨基酸，包括酪氨酸（Y）, 苯丙氨酸 （F）, 和色氨酸 （W），直接插入CDR3 顶端或者将CDR3顶端的氨基酸突变成这个带芳香环的氨基酸，去模拟配体与疏水核的结合。令人惊喜的是，单个酪氨酸的插入（突变体JN241-9）使得JN241从一个强的抗体拮抗剂 (在cAMP 实验中，IC50为5.9 nM )变成了一个强的抗体激动剂 （在cAMP 实验中，EC50 为36 nM）。研究小组进行了分子模拟实验，发现JN241-9 中插入的酪氨酸确实与APJ受体的配体结合部位的疏水核发生互作。JN241-9 与APJ受体的结合引起受体一系列的构象变化，最终激活受体。这个过程很好地模拟了配体类似物与APJ受体的结合和受体的活化过程。因为涉及与JN241-9互作的APJ上关键氨基酸残基在以短肽作为配体的G 蛋白偶联受体中非常保守。研究人员推测这些受体的激活要素和过程可能与APJ非常类似。所以这个研究结果有可能用于研发这类G 蛋白偶联受体的肽类或抗体类激动剂。

研发小组正在进行JN241-9与APJ受体复合物的共结晶，以便更好到诠释G 蛋白偶联受体活化的机理。

安进亚洲研发中心成立于2014年。综合大分子和小分子药物研发能力，以及结构生物学的研究能力。本文的通信作者是章美云博士，于2015年加入安进亚洲研发中心，一直担任抗体研发部门的主管。

原文链接：

https://advances.sciencemag.org/content/advances/6/3/eaax7379.full.pdf

参考文献

1.    C. J. Hutchings, M. Koglin, W. C. Olson, F.H. Marshall, Opportunities for therapeutic antibodies directed atG-protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov 16, 787-810 (2017).

3.    M. A. Ayoub et al., Antibodies targeting Gprotein-coupled receptors: Recent advances and therapeutic challenges. mAbs 9,735-741 (2017).

4.    E. Dolgin, First GPCR-directed antibodypasses approval milestone. Nat Rev Drug Discov 17, 457-459 (2018).

5.    A. Mullard, FDA approves secondGPCR-targeted antibody. Nat Rev Drug Discov 17, 613 (2018).

6.    S. Jain, H. Yuan, N. Spare, S. D.Silberstein, Erenumab in the treatment of migraine. Pain Manag,  (2018).

7.    P. Yang et al., Elabela/Toddler Is anEndogenous Agonist of the Apelin APJ Receptor in the Adult CardiovascularSystem, and Exogenous Administration of the Peptide Compensates for theDownregulation of Its Expression in Pulmonary Arterial Hypertension.Circulation 135, 1160-1173 (2017).

8.    K. Kuba, T. Sato, Y. Imai, T. Yamaguchi,Apelin and Elabela/Toddler; double ligands for APJ/Apelin receptor in heartdevelopment, physiology, and pathology. Peptides,  (2018).

9.    E. A. Ashley et al., The endogenous peptideapelin potently improves cardiac contractility and reduces cardiac loading invivo. Cardiovasc Res 65, 73-82 (2005).

10.  A. G. Japp et al., Acute cardiovasculareffects of apelin in humans: potential role in patients with chronic heartfailure. Circulation 121, 1818-1827 (2010).

11.  Y. Ma et al., Structural Basis for ApelinControl of the Human Apelin Receptor. Structure 25, 858-866.e854 (2017).