华东理工大学刘润辉教授再发《自然·通讯》！

    抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种生命力非常强、毒性和致死率非常高的微生物，在医院和社区中广泛存在，对人们的健康造成了严重的威胁。

    强的抗抗生素特性以及传播的广泛性使得生物体内缺乏针对这种病菌的有效抗体。

    因此，开发一类针对MRSA的新型抗生素是一种十分紧急的需求。

    宿主防御蛋白（HDPs）是一种非常具有潜力的抗体候选者。

    这种蛋白具有广谱的抗菌活性以及对抗菌素耐药性的低敏感性。

    然而，由于较低的稳定性、较高的成本以及繁琐耗时的制备过程而使HDP的应用受到了很大的限制。

    使用具有类似功能的肽模拟物是目前人们开发的一个新思路。

    拟肽就是这一思想的产物。

    这类物质可以具有与真正的肽类相似的抗菌性质，同时其结构与真正的HDP差别很大，难以被蛋白酶水解，因此结构相比HDP更加稳定。

    然而，尽管具有如此优越的性质和应用潜力，对HDP拟物的研究仍然非常少，而且这些HDP拟物的制备同样是繁琐耗时的。

    为此，华东理工大学刘润辉教授团队通过氨基酸N-取代的N-羰基酯的开环聚合（ROP）机理设计和合成了一系列拟肽聚合物，这些拟肽聚合物具有在小鼠伤口模型、小鼠角膜炎模型和小鼠腹膜炎模型中的超强抗MRSA感染特性。

    该工作以题为“Addressing MRSA infection and antibacterial resistance with peptoid polymers”发表在《Nature Communications》上。

    【拟肽聚合物合成及原位抗菌研究】之前的研究表明，抗菌聚合物能够通过端基处的官能团种类的调控来调节抗菌活性。

    受到这些研究成果的启发，作者设计了7种具有不同性质端基（如亲水基团PEG或疏水基团烷基、芳基等）的聚合物。

    并通过α-氨基酸N-取代的N-羰基酯单体，经过开环聚合（ROP）方法以及伯胺作为聚合引发剂合成了这些聚合物。

    这些聚合物具有C末端功能化的特点以及具有较窄的分子量分布（分散度为1.08-1.12）。

    图1. 拟肽聚合物的合成初步试验显示，这些化合物表现出对革兰氏阳性细菌的抗菌活性。

    尤其是针对五种类型的MRSA变种（包括S. aureus Mu50, S. aureus Newman, S. aureus USA400, S. aureus USA300 LAC, 和S. aureus USA300），以及三个药物敏感性变种（包括S. aureus ATCC6538, S. epidermidis 49134 和 B. subtilis BR-151）。

    其中，聚合物末端带有巯基的聚合物针对这些细菌的表现稍好，其最低抑菌浓度（MIC）以及最低杀菌浓度（MBC）分别为3.13-12.5 μg/mL和3.13-25 μg/mL。

    随后，作者使用末端为巯基的聚合物作为模型化合物，测试其抗细菌S. aureus ATCC6538的活性。

    通过控制单体和引发剂的比例，作者合成了几种不同链长的聚合物，分别包含5，10，20和40个单体的聚合。

    实验结果显示，在末端官能团相同的情况下，链长对聚合物的抗菌活性也具有显著影响。

    具有20和40个单体聚合的聚合物显示出了更好的抗菌活性，其MIC为12.5μg/mL。

    同时这两种具有较长链长的聚合物也显示出了较低的溶血性和细胞毒性。

    另外，具有20个单体的聚合物（HS(Naeg)20）显示出了更好的HC50值（10000 μg/mL，导致50%溶血的浓度）、IC50值（400 μg/mL，导致细胞活力降低 50% 的最低浓度）以及更高的抗菌选择指数（HC50/MIC > 800，IC50/MIC = 32）。

    针对多种临床分离出来的耐药甚至多重耐药的革兰氏阳性细菌，具有20个单体的聚合物也显示出了较好的抗菌活性，MIC值在1.56-25 μg/mL之间。

    值得注意的是，在模拟生理环境的血清中，这些拟肽聚合物的MIC和MBC值都几乎保持恒定。

    图2. 聚合物抗菌活性【抗菌机理】细胞质膜去极化实验表明，HS(Naeg)20仅展示出了适中的去极化能力。

    接着作者合成了端基带有吗啉代萘酰亚胺绿色荧光染料片段的聚合物dye-(Naeg)20，并将该聚合物的溶液在一倍MBC条件下与细菌S. aureus共同培养。

    使用延时共聚焦成像的方法观察到，聚合物在400秒内快速进入细菌细胞质，而没有在细胞膜处富集。

    这表明，类肽聚合物可能像先前文献中报道的一些阳离子抗菌肽一样通过直接易位穿透膜：带正电荷的聚合物与细菌膜带负电荷的组分的相互作用使膜双层不稳定，产生跨膜通道，从而允许类肽聚合物 在没有膜裂解的情况下进入细菌细胞。

    通过仔细观察，作者还发现，HS(Naeg)20还能与DNA结合。

    这种结合阻碍了DNA的功能。

    进一步研究发现，该结合可以导致细菌细胞内活性氧物种（ROS）水平在30分钟内快速提高5.5倍，超高的活性氧水平导致细菌快速死亡。

    因此，使用这些拟肽聚合物可以实现快速杀菌及根除持久性细菌和生物膜的目的。

    图3. 抗菌机理【原位抗感染】作者将将 MRSA 悬液涂在伤口上并感染 24 小时，然后用类肽HS(Naeg)20进行局部治疗。

    相比于生理盐水对照组，使用HS(Naeg)20可以在小鼠伤口上显著减少细菌感染水平，其效果远好于使用万古霉素治疗。

    此外，作者还使用HS(Naeg)20治疗其他细菌如S. epidermidis 和 S. haemolyticus感染的免疫抑制小鼠的伤口。

    结果表明，拟肽聚合物具有与万古霉素相同甚至更好的抑菌效果。

    在小鼠角膜炎模型中，HS(Naeg)20可以治疗小鼠的每一只眼，而万古霉素则对该感染无效。

    作者在小鼠中通过腹腔注射引入致死量的MRSA，未经治疗的小鼠在12小时内全部死亡。

    注入单剂量的聚合物（20 mg/kg）可以显著提升小鼠的存活率（5/6存活），与万古霉素效果相当。

    表明这种聚合物具有较好的抗系统感染的活性。

    同时，聚合物也显示出了对小鼠腹膜炎S. epidermidis 和 S.haemolyticus感染的活性。

    在小鼠腹膜炎模型中，生理盐水组为66.7%的死亡率，万古霉素组为4/6的存活率，而聚合物组为100%的存活率！

    体内毒性研究表明，与空白对照组相比，HS(Naeg)20治疗后2天和7天，肝肾重要临床生物标志物无明显差异，无明显组织损伤。

    值得一提的是，在先例研究中已经报道了许多具有抗菌特性的拟肽聚合物，但其中大多数是体外抗菌活性的概念验证演示和简单的体内研究。

    在多种动物模型中的低体内毒性和高体内抗菌功效表明，该工作中的最佳拟肽聚合物是治疗药物的有希望的候选者。

    总结，该工作通过分子设计合成了一系列具有抗MRSA活性的拟肽聚合物。

    通过体外和体内对于多种细菌及MRSA变种的对照测试，表明了这些化合物，尤其是带有巯基的聚合物具有十分优良的抗MRSA感染的性质。

    为未来新一代抗生素药物的设计和开发提供了十分有价值的借鉴。

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