昼夜节律行为调控的新机制

在哺乳动物中，下丘脑视交叉上核(SCN)是哺乳动物脑内的昼夜节律起搏器，通常分为腹外侧部分（核心区）和背内侧部分（壳区）。

核心区作为外部信息输入的整合者，通过视网膜下丘脑束，接收来自光敏感视网膜神经节细胞(ipRGCs)的信息，传递至下游核团并设置相应的SCN神经元振荡相位。

然而，SCN对光反应的分子机制尚不完全清楚。

神经元PAS结构域蛋白4（Neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4, NPAS4）是一种碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族成员蛋白，其在视觉皮层中的表达受光诱导，是SCN中与神经元兴奋相关的急性即早基因（IEG）之一，具体功能知之甚少。

德克萨斯大学西南医学中心Joseph S. Takahashi团队，在《Neuron》杂志发表了题为“NPAS4 regulates the transcriptional response of the suprachiasmatic nucleus to light and circadian behavior”的研究。

本研究中，使用染色质免疫沉淀技术、单细胞RNA测序和昼夜节律行为分析，检测不同光照时间点小鼠SCN中IEG的表达水平，以探索光诱导基因的整体动力学。

本研究发现，NPAS4缺失改变了小鼠昼夜节律行为，可能在介导下丘脑对光的反应中发挥了重要作用。

研究结果SCN对光有不同的转录组反应为分析SCN在急性持续性光暴露后的转录组反应，在光刺激(0、1、3和6小时）后对整个小鼠SCN进行单细胞RNA测序。

为确定导致C57BL/6J小鼠对昼夜节律相移的光脉冲反应，作者将雄性小鼠饲养于黑暗环境中，并在昼夜节律时间(CT)诱导最大延迟。

通过免疫组化分析光刺激后SCN中FOS表达，结果表明，光照暴露0.5小时后FOS表达升高，并在暴露1小时后达到峰值(图1)。

因NPAS4结合位点位于皮质神经元的FOS增强子，研究NPAS4是否协调SCN神经元的光调控转录反应。

作者通过乙酰化H3K27ac进行染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)寻找SCN中活性增强子，发现SCN具有持续的H3K27ac基础水平。

在哺乳动物的核心生物钟基因中，Per1和Per2介导了生物钟的转录输入机制。

在Per1位点中，H3K27ac和H3K4me3在三个备选TSSs(TSS1-TSS3)上有强烈的富集；在Per2位点中，启动子区出现NPAS4富集。

这表明NPAS4可能是Per1/Per2基因表达的上游调控因子，从而支持NPAS4参与SCN中光诱导基因表达调控的假说。

图1：光照驱动SCN中不同的转录组变化SCN中的光响应细胞亚群SCN神经元对光反应具有异质性。

为了解SCN中光响应细胞亚型的整个谱系，在光（或无光）刺激1小时后对SCN组织进行单细胞RNA-seq，确定了45个簇，根据已知标记物分为7种不同细胞类型。

差异表达(DE)分析发现，神经元和星形胶质细胞之间的DE基因序列显著不同，表明细胞类型对光有特异性反应。

为进一步完善聚类，接下来研究已知的SCN基因和神经元簇中排除的非SCN基因的表达。

通过荧光原位杂交(FISH)检测不同光响应簇中Fos、Egr和Per1的表达。

对每种重聚细胞类型的光/暗库进行DE分析，结果表明肽神经元细胞类型对光的特异性反应(图2)。

有趣的是，在光响应簇中，假定的NPAS4靶点显著富集Vip+簇最强，其次是Cck+和Avp+簇(图2H)，从而支持了NPAS4调控所有光响应肽能SCN神经元中基因表达。

图2：SCN神经肽细胞簇可以通过它们对光的反应进一步分类SCN中NPAS4的缺失会导致昼夜节律行为的改变虽然NPAS4在皮层多种细胞中表达，但具有明显的细胞特异性功能，如兴奋或抑制，这取决于昼夜节律阶段或SCN亚区。

为研究NPAS4在光刺激行为反应中的功能，检测同窝NPAS4+/+、NPAS4+/-和NPAS4-/-小鼠的昼夜运动活动节律。

结果如图3所示， NPAS4缺失是大多数光诱导基因在光刺激下表达变化的基础，并导致光振幅相位响应曲线降低。

图3：缺乏Npas4的小鼠表现出异常的昼夜节律，对光的相位反应减弱，昼夜节律周期长。

综上，本研究发现缺乏NPAS4的小鼠有更长的昼夜节律周期，对光的相位响应曲线延迟，并且在SCN中光诱导的基因表达降低，表明NPAS4在光捕获效应和昼夜节律起搏器的动力学中发挥重要功能。

比较视觉皮层中的光诱导基因和SCN中Vip+神经元、Cck+神经元和星形胶质细胞，除FOS外诱导基因没有重叠，表明活性诱导基因的表达具有细胞特异性。

此外，对光的转录反应随着光照时间的延长而显著不同，在每种SCN神经肽细胞类型中并不相同，表明SCN中的神经元和非神经元细胞存在不同的转录反应。