Nat Commun.评论：抗体特异性如何影响抗原决定簇分析

来源：逻辑神经科学

作者︱Mark Helm（德国约翰内斯·古滕贝格大学）

有关mRNA中RNA修饰m1A的争议出现了新转折，一种在修饰映射中起中心作用的抗体也被证明可以结合mRNA帽子结构。

抗体作为修饰映射的工具

RNA修饰是使标准RNA构建块的功能多样化的化学改变。新的定位方法对真核生物mRNA的修饰含量及其调控基因表达的潜力引起了人们的广泛关注。

最近，Grozhik, A. V等人报告了针对RNA修饰m1A的抗体的特异性差异，以及它们如何影响修饰。重要地，这项研究表明了两者之间的相关性：以前使用的抗体除了m1A外还能与cap结构结合，而且以前报道的m1A映射结果可能在mRNA的5 '端包含大量假阳性【1】。

虽然抗体特异性的变化是常见的，但Grozhik, A. V和他的同事的这项研究可能会使人们认识到特异性验证对依赖抗体的RNA修饰图谱的重要性。是什么让这个结果如此重要？抗体生物技术——以及它产生的许多重要工具——通常依赖于一种组合方法来识别与特定表位高度亲和的分子。在肽结合的环境中，典型抗体的可变区识别5-12个氨基酸的表位，这些表位具有显著的功能群多样性，可以调节亲和力和特异性【2】。这种情况对于核酸来说是不同的，因为它们具有相对有限的结构多样性，相应的也没有明确的主表位。

针对核酸修饰的抗体在表观遗传学和抗原决定学中发挥了重要作用。在甲基化RNA免疫沉淀（methylated DNA immunoprecipiatation，MeRIP）流行之前，甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）富集含5mC的DNA几十年来一直是表观遗传学研究中被广泛使用的技术。其实MeRIP实验早在1980年就已经出现了【3】。在2012年里，与RNA- seq的结合才使MeRIP技术成为了RNA修饰领域的一项突破性技术，当时两个团队分别报告了哺乳动物mRNA中m6A修饰的图谱【4-5】。从那时起，一些抗体被用于描绘各种RNA修饰图，对领域发展产生了重大影响。关于抗体特异性的问题已经被讨论过，但在很大程度上仍未被认识到【6】。

抗体的脱靶结合是一个普遍存在的问题

最近，在DNA修饰领域的研究已经开始确定人工制品的来源。例如，低丰度的主表位可以放大固有的交叉反应性问题。这一案例表明，抗体对污染细菌核酸的交叉反应可以干扰真核生物DNA8的修饰分析【7】。值得注意的是，在高等真核生物的DNA中，dm6A和dm4C的存在受到了抗体无关分析的质疑【8-9】。最近的另一项研究表明，几种针对DNA修饰的抗体以不依赖修饰的方式与短串联重复序列发生交叉反应，从而产生高达99%的实验噪声【10】。

由于这种抗体的研发和不断改进中包括了通过修饰的核苷的氧化糖部分与蛋白质结合的步骤，因此，无论在DNA或RNA中发现修饰后的碱基，修饰特异性抗体都有望识别修饰后的碱基【11】。因此，Grozhik等人对MeRIP实验中特异性问题的论证不应该令人感到惊讶；确切地说，这是一个期待已久的、令人信服的实验证明：在RNA修饰领域中对依赖于抗体的人工制品的详细实验证明【1】。除了为该领域提供整体的实验指南外，该研究还发现了一种商业上可用的抗m1a抗体与cap结构的意外结合。此外，该研究为哺乳动物mRNA中存在的m1A残基的数量这一有争议的讨论提供了重要的澄清。更具体地说，Grozhik等人报告的结果表明，m1A在mRNA中并不常见，而且在以前的研究中，这种修饰的普遍性被大大高估了。在MeRIP类型实验中，对两种m1A抗体的比较评估出现了巨大差异，这可能性指向了该领域的一个普遍问题。首先，应谨慎使用特定抗体的说明书和特异性声明，并最好使用相关对照实验对每个步骤进行确认。其次，现在应该清楚的是，通过简单的方法如点印迹实验（dot blot experiments）来确认抗体的特异性是不够的【12-13】。在该领域开发的许多验证技术中，Grozhik等人明智地应用了质谱和薄层色谱来表征经MeRIP1分离的物质的理化性质【1,6】。对常用的各种抗体进行系统的描述可能是非常有益的，正如在不远的组蛋白修饰领域所显示的那样，使用肽阵列对抗体特异性进行了系统评估，并发现了许多年前就存在的特异性问题【14】。

抗体特异性之外的考虑

在更基本的层面上，人们可能会质疑核酸片段中的一个甲基是否真的能够为MeRIP 实验或其他类似技术提供足够的选择性。虽然我们对结合模式的理解有限，但很明显，主表位不仅可以是修饰本身（即甲基），还可以延伸到修饰后的碱基（即腺嘌呤）等。因此，尽管其亲和力低于甲基化腺嘌呤，RNA中所有的腺嘌呤都参与了结合竞争。在这种情况下，富集受修饰残基和未修饰残基的相对亲和性及其相对丰度的控制。这进而意味着，未经修饰的RNA（包括多聚尾巴）中的任何腺嘌呤都可能导致非特异性结合，尤其是在修饰丰度较低的情况下。因此，MeRIP实验中报道的富集因子低至4-10倍也就不足为奇了【15】。对于相对丰富的修改，如m6A，这可能仍然足以产生可信的映射结果。然而，这可能不是RNA修饰量较少的情况（案例）。

对于一般的MeRIP，还存在一些超出抗体特异性的附加问题，这些问题可能会歪曲修饰映射实验的结果。其中一些问题与Illumina测序的实验设计和所用的文库制备协议有关。例如，早期的报告忽略了唯一分子标识符的使用，进而导致了PCR人为地放大了噪声【6, 16】。RNA-Seq改造设计也会产生的潜在人为误差【17】。此外，RNA-Seq数据的计算分析中存在的问题，比如，读映射中的歧义是已知的误差源【18】。最后，该领域需要严格的统计数据分析标准。考虑到所有这些局限性，新报道的RNA修饰分析的映射技术所获得的大量数据集应该被视为候选修饰位点的集合，而不是实验确定的修饰位点【19】。因此，下一步的工作应该是开发和应用多种正交方法来验证修饰位点和全基因组模式【6】。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41467-019-13684-3

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参考文献

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