合成生物标志物：21世纪早期癌症检测之路

本文由中国科学院上海营养与健康研究所 战略情报团队供稿

在癌症早期检测中，生物标志物因血液循环等生理过程被稀释，检测结果因此受限。为解决这一问题，研究人员提出了一种新型诊断方式，即在体内引入生物工程传感器来检测早期肿瘤，将疾病信号放大至可被检出的水平。这些策略利用了化学、合成生物学和细胞工程的设计原理和进展。Nature Reviews Cancer于2021年9月6日刊登了题为“Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection”的综述，讨论了合成生物标志物用于癌症诊断中的进展及临床挑战。

早期癌症检测的目标是在临床症状出现前检出侵入性肿瘤，进而在肿瘤转移之前提高手术切除等医疗干预措施的效果。近几年，血液和其他体液中内源性生物标志物（如无细胞核酸、蛋白质、脂质和代谢物等）的研究进展迅速，循环肿瘤DNA（ctDNA）等生物标志物成为癌症基因检测的重大突破。然而，临床实践中绝大多数癌症无法通过血液等非侵入性检测准确测出。由于循环系统的稀释作用，血液生物标志物的信号水平需要极高灵敏度的检测设备才可测到，而且大量生物标志物缺乏特异性，影响疾病评估的准确率。

癌症生物标志物和早期检测的经验为基于生物工程传感器的合成生物标志物研究提供了基础。生物工程传感器能够识别肿瘤生物标志物，并产生放大的信号，发挥肿瘤检测和监测的作用。本文概述了合成生物标志物的研究进展与技术挑战。

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肿瘤早期检测面临的挑战

在患有同一种肿瘤的患者体内，生物标志物的分泌率变化跨越4个数量级，而且极易受到健康组织的干扰。在非小细胞肺癌患者中，1cm3、10cm3、100cm3的肿瘤分别导致0.006%、0.1%、1.3%的变异等位基因频率（VAF）。此外，ctDNA在血液中的循环半衰期小于1.5小时。因此，在临床实践中，正电子发射断层扫描（PET）等分子影像往往能够更准确地识别肿瘤组织。

虽然生物标志物检测面临技术挑战，但数学模型和基因组分析显示，癌症检测的机会窗口能够至少提前10年。人体内肿瘤发生的前10年内无法被发现，单个肿瘤细胞在远端器官中生存并形成组织需要7年或更长时间。相比之下，生长迅速和具有高度侵略性的癌症，则可能在几个月到几年的狭窄窗口期内迅速发展，导致临床治疗结果较差。侵略性癌症的早期发现需要尽快识别癌症前体。合成生物标志物将突破内源生物标志物产生的生物学和生理学限制，利用生理活动和基因编码机制进行早期检测。

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基于生理活动的合成生物标志物

利用外源性制剂进行体内生物功能的系统管理，这一领域已有悠久的研究历史，例如，向患者输送胰蛋白等不易消化或吸收的惰性多糖来检测肾脏功能等。这些方法主要利用具有生物惰性的探针来检测疾病相关的已知生理学特征，从而产生传统方法难以测出的生理读数，使输出端信噪比最大化。肿瘤合成生物标志物主要包含由肿瘤微环境中的酶类激活的传感器组件，进而放大肿瘤生物标志物的分子信号。基于生理活动的肿瘤合成生物标志物通常分为蛋白酶激活传感器和小分子探针两类。

蛋白酶激活的合成生物标志物。人类基因组中至少有550个蛋白酶，其在分子、细胞、系统水平表达异常，影响癌症的发展。大多数癌症中基质金属蛋白酶（MMP）表达过度，其关键功能是调控血管内皮生长因子（VEGF）并开启血管生成过程，而血管生成在肿瘤直径到达0.5 mm时就会启动。蛋白酶的异常表达可用于前列腺癌、肺癌等肿瘤的诊断和分类。蛋白酶激活的合成生物标志物包括与惰性载体表面结合的肽基，能够识别肿瘤蛋白酶裂解，相关产物可释放至血液和尿液。早期检测的另一个关键策略在于提高体液中合成生物标志物的浓度。研究人员提出一种借助肾脏过滤机制的方法，即构建一个直径大于5 nm的球状载体，当合成生物标志物被肿瘤蛋白酶从载体表面切开后，能够被释放至循环系统中并被检测出。蛋白酶能够切割多种蛋白分子，限制了单个传感器的检测特异性。研究人员提出了一种多路复用的生物传感器文库设计原则，即制备含有多个合成生物标志物的混合物，并通过分子条码的技术来检测裂解产物。配合机器学习算法，含有多个合成生物标志物的混合物在疾病检测方面具有更高的灵敏度和特异性，在临床实践中具有更大潜力，而且还有可能发现新的生物学知识。

小分子探针。肿瘤特异性抗原、细胞表面标记物和代谢通路都能与小分子靶向结合。研究人员正在开发工程化的分子探针，其与癌症特异性分子结合产生合成生物标志物，可用于癌症检测。日本庆应义塾大学的研究人员报告了一种利用两步策略靶向癌细胞表面凝集素生成合成生物标志物的策略，在携带肿瘤的小鼠中，血浆中诱导产生的乙酰氨基酚水平在60 min内快速升高，这一过程可被用于推断肿瘤组织的存在。具有同位素标记的小分子在实验室中已经被广泛用作诊断探针的元件，目前经美国FDA批准，已经用于肝纤维化背景下肝功能障碍的测量，而肝纤维化是肝癌发生的重要危险因素。患者呼吸样本中的天然挥发性有机化合物（Volatile Organic Compound，VOC）也可用于癌症诊断。法国普瓦捷大学使用同位素标记EtGlu（一种乙醇代谢产物），在静脉注射至体内后EtGlu被β葡萄糖酶（由实体肿瘤分泌的细胞酶）转化为D5-乙醇，可通过气相色谱和高分辨率质谱在呼吸中检测中。在小鼠肿瘤模型中，研究人员根据D5-乙醇的代谢水平来评估肿瘤水平及化疗效果。

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基因编码的合成生物标志物

人工设计的哺乳动物合成生物学正在突破生物传感器的限制。基因编码是另一种策略，即使用工程组件或细胞来提高合成生物标志物的释放水平。这一策略的优势在于将合成生物标志物转化为特定表型的细胞，能够有效避免健康细胞产生的干扰。目前基因编码的合成生物标志物主要基于载体、哺乳动物细胞和细菌。

基于载体的合成生物标志物。基因载体的转录是调控靶标组织中基因表达的有效方法。这一系统包含两个关键组件：组织或癌症特异性的启动子和被释放至血液和尿液的合成生物标志物。组织特异性的启动子具有较高的靶向性，能够准确定位至特定器官，而癌症特异性的启动子具有较高的转录能力，能够明显区分癌症细胞和正常细胞。基于载体的合成生物标志物面临的挑战在于：病毒载体容易导致机体产生免疫原性反应，其使用安全性有待验证，而质粒载体则存在表达率低的问题。

基于哺乳动物细胞的合成生物标志物。细胞疗法的成功应用启发了生物传感器的设计想法，即使用哺乳动物细胞作为诊断工具。与分子探针依赖血管的被动扩散在肿瘤中积累相比，细胞能够进入和渗透到癌症部位，甚至参与癌症进展。斯坦福大学的研究人员进一步发展了基于细胞的诊断概念，选择M2型巨噬细胞作为工程巨噬细胞，经过设计，工程巨噬细胞可表达并分泌和胞内两种与肿瘤代谢相关的蛋白生物标记物，通过将荧光素酶的表达与标志物基因启动子的激活偶联，静脉注射后，巨噬细胞可归巢至疾病部位，借助荧光成像，检测血液是否存在生物标志物，在小鼠肿瘤模型中可检测25-50 mm³的肿瘤，检测肿瘤的最小直径为4 mm，比临床使用的蛋白质、核酸等癌症生物标志物灵敏度更高。这项研究为细胞免疫诊断奠定了基础，由于其他免疫细胞同样能够调节肿瘤微环境下的基因表达，这种方法也可以扩展到T细胞、B细胞、自然杀伤细胞中。然而基于细胞的诊断试剂制造工艺复杂，制造成本较高，目前还难以成为常规筛选工具。

基于细菌的合成生物标志物。归因于肿瘤中坏死细胞释放的营养物质增加，某些细菌能够渗透进入肿瘤组织并选择性生长，因此工程化细菌可用作癌症检测的工具。马萨诸塞大学阿默斯特分校的研究人员构建的毒性降低1万倍的工程化沙门氏菌，注射入肿瘤小鼠模型后，能够检测120 mg的肿瘤组织。基于细菌的合成生物标志物的稳定性较低，该系统会随着体内环境变化而难以发挥功能。此外，虽然工程菌株已被证明在动物和人体内几乎没有致病性，但细菌的固有特性及其潜在毒性可能产生安全问题。

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临床前研究

临床前研究已经证明，合成生物标志物有望达到或突破早期检测极限。在小鼠模型中，蛋白酶激活的合成生物标志物能够识别130 mm3的结肠直肠肿瘤，比血清生物标志物检测出的肿瘤小60%，而ctDNA只能检测体积超过1000 mm3的结肠直肠肿瘤。根据尿液中的生物标志物，研究人员能够检测出直径小于2 mm的肿瘤组织，而阴道超声波扫描只能测出直径超过5 mm的肿瘤组织。目前，研究人员正针对不同肿瘤模型改造或优化生物标志物结构，进而提高肿瘤早期检测的精确度。

 用于肿瘤早期检测的不同类型合成生物标志物

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临床转化的挑战趋势

目前，合成生物标志物研究缺少准确的实验模型。大部分实验用癌细胞系来自晚期转移性肿瘤，这类细胞难以充分反映早期或癌前疾病。此外，不同个体癌细胞产生的内源性生物标志物的浓度差距跨越4个数量级，较难在实验室中得出评价基线。基因工程动物模型和数学模型将为未来合成生物标志物的研究提供新平台，推动癌症早期诊断技术发展。

啮齿动物模型与人类具有若干共有的蛋白代谢途径，因此理论上在小鼠模型中观察到的蛋白酶和信号放大过程能够应用于人类，且肿瘤转染效率、生物标志物分泌率和降解率、检测试剂安全窗口等也可根据小鼠实验进行推算。然而，小鼠与人类的血液体积和尿液容积存在量级差异，其分子信号未必按照线性趋势变化。例如，若合成生物标志物可识别5 mm3的小鼠肿瘤，不能直接推算出该生物标志物能够识别体积大3500倍的人类肿瘤。合成生物标志物的信号放大还需要在更多模式生物中进行验证。

在癌症筛查的应用实践中，血液或尿液的检测效果有限，因为其无法对肿瘤组织和侵袭器官进行定位。研究人员正在开发能够报告器官特异性蛋白酶的探针，或将合成生物标志物与不同内源性分析结果和临床变量相结合，以便预测潜在的肿瘤部位。此外，生物影像技术的参与也能够提高肿瘤定位能力。

在具体的临床实践中，可能需要使用合成探针的混合物来预测肿瘤异质性、住院期间变化和合并症。在小鼠实验中，使用多路探针可能出现肝纤维化、肺炎等不良反应。合成生物标志物在进行临床研究前还需证明其在人体内的安全性。此外，研究人员还在研发具备多种预测功能的“超级探针”，一旦验证其安全性和免疫原性，即可投入临床试验。

虽然合成生物标志物这一新兴领域令人振奋，但由于对癌症发病机制的认识不足，这一领域充满着科学与技术挑战。生物工程师、临床医生等多学科团队应开展综合性战略合作，回答以下问题：目前生物学和发病机制的研究是否足以推动合成生物标志物发展？机器学习如何支持复杂生物数据集中关键特征的识别，进而改善合成生物标志物的预测能力？哪些人群能够从早期癌症发现中获得最大收益？生物工程传感器的短期或长期耐受性状况如何？患者接受筛查的间隔时间是多久？生物工程传感器是否会导致患者合并症或并发症？何种探针可用于检测癌症复发？与目前的诊疗标准相比，长期监测“风险”患者的成本多高？如何克服患者个体和肿瘤组织的异质性？数学模型如何推动合成生物标志物的发展？虽然目前上述问题还未得出明确的答案，但通过集体、多学科的创新工作，解决方案将很快出现。

袁天蔚 编译整理自：

Kwong, G.A., Ghosh, S., Gamboa, L. et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer (2021).