拟南芥表观遗传因子FVE协同参与胞质内转录后基因沉默途径的新功能

撰文 | HY（RES）

2021年8月4日，Science Advances在线发表了美国德克萨斯农工大学生物化学和生物物理学系张秀任（Xiuren Zhang）教授团队题为“The epigenetic factor FVE orchestrates cytoplasmic SGS3-DRB4-DCL4 activities to promote transgene silencing in Arabidopsis”的研究论文。该研究发现调控开花的表观遗传因子FVE（Flowering locus VE）通过协同调控细胞质中的SGS3-DRB4/DCL2/4活性来促进转基因衍生的siRNA产生，揭示了FVE是转录后基因沉默中的新参与者。

研究背景

转录后基因沉默 (PTGS) 是一种可抑制内源基因表达的调控机制，同时还能降解转基因和病毒转录物在内的侵入性RNAs。PTGS由微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)引导，两者可以高效、特异性地调控靶基因的表达。miRNA是内源性产生的非编码蛋白RNA序列，其前体被DICER-LIKE1（DCL1）切割加工成成熟的miRNAs，随后被加载到 Argonaute蛋白（AGO）以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。siRNAs的作用方式与miRNAs类似，而植物启动siRNA介导的RNA沉默的先决步骤是由RNA依赖性RNA聚合酶 RDR6和基因沉默抑制子SGS3作用将单链RNA(ssRNA)底物转化为双链dsRNA。SGS3作为同源二聚体发挥作用，可稳定用于dsRNA合成的初级小RNA(sRNA)切割产物；dsRNA随后被DCL2/DCL4及其结合蛋白DRB4加工成21-22nt的siRNA。与这些加工处理因子相比，目前对RDR6/SGS3-DCL4/DRB4的协同调控因子和功能桥梁的了解还比较少。

研究结果

本研究利用LUC活性检测的正向遗传筛选策略鉴定出一个RNA沉默减弱的突变体attenuated RNA silencing 1-1(ars1-1)，图位克隆以及晚花表型回补验证表明FLOWERING LOCUS VE(FVE)位点突变是导致miRNA介导的沉默发生缺陷的原因，导致LUC活性增加。因此，该突变体被重命名为fve-8。已知FVE除调控开花时间和低温胁迫敏感性之外，还可充当大型复合物组装的结构支架，参与表观遗传沉默；通过RNA依赖性DNA甲基化机制促进转座子（如AtMu1和AtSN1）的转录沉默。尽管其在表观遗传水平上的功能已被充分鉴定，但FVE在PTGS中的功能机制尚不清楚。

表达分析验证发现，fve-8并非通过核内转录水平的基因沉默(TGS)途径发挥功能。FVE蛋白同时定位于核质，利用核输出信号引导FVE在细胞质中特异性高表达，结果发现胞质FVE在功能上足以沉默LUC转基因。值得注意的是，核定位的FVE，而非胞质FVE，在表观遗传水平上抑制内源AGO10的转录，但并不抑制LUC转基因转录。该结果进一步表明FVE在表观遗传水平上对内源基因和转基因的影响不同，即除了在细胞核中对内源基因的经典表观遗传调控作用外，细胞质中的FVE还以非经典方式在PTGS水平调控LUC的表达（图1）。

图1. FVE 通过PTGS途径调节 LUC 表达

检测发现fve-8对内源性sRNA生物发生的影响可以忽略不计，表明FVE几乎不影响内源PTGS途径。sRNA-seq数据集显示fve-8中衍生自GFP-PHB-LUC转基因的21-22nt sRNA显著减少。结合正义转基因-PTGS通路分析的模型系统表明FVE确实参与转基因-PTGS途径。此外，FVE还参与反向重复转基因触发的沉默途径。

酵母双杂筛选及验证发现，FVE与SGS3特异性互作，并靶向细胞质颗粒。FVE-8是FVE的截短形式，编码N端413个氨基酸残基，缺少最后两个WD40（trp-asp二肽）结构域，发现其并不能与SGS3互作。BiFC测定以及酵母三杂等实验结果显示fve-8影响 SGS3同源二聚化，从而影响SGS3介导的体内功能。SGS3和RDR6在特定细胞质颗粒中互作并形成SGS3/RDR6小体，而体外重组试验表明，FVE对体外RDR6/SGS3活性并无显著增强作用。EMSAs与核糖核蛋白IP(RIP)实验结果显示，FVE可以与ssRNA和dsRNA结合，表明FVE为体内RNA结合蛋白。FVE-8同样与ssRNA结合，但只有FVE能够促进 SGS3-ssRNA结合，这进一步暗示FVE可以促进和加强SGS3与转基因转录本的结合，以在体内产生dsRNA。

RDR6/SGS3产生的dsRNA被引导到至DRB4/DCL2/4复合物进一步加工，DRB4是DCL4的辅助因子。经验证发现，FVE、FVE-8和SGS3均能与DRB4互作，这表明FVE/SGS3/dsRNA 核糖核蛋白复合物可以通过FVE/SGS3/DRB4互作被引导至DRB4/DCL2/4机制。此外，体外重组试验表明，FVE可能通过与DRB4互作来促进DCL4活性，而FVE-8尽管与 DRB4互作，但仍会劫持dsRNA并抑制其加工（图2）。

图2. FVE促进而FVE-8抑制DCL2/4-DRB4 复合活性

一图解文

图2（I）FVE在转基因沉默中的功能模型。FVE促进SGS3在ssRNA底物上的二聚化和启动，这反过来又招募RDR6以在体内产生dsRNA。随后，FVE/SGS3/dsRNA被易位到 DCL4/DRB4复合物用于产生siRNA。相反，FVE-8不与SGS3互作并且不能有效促进 RDR6/SGS3与ssRNA底物的结合。此外，FVE促进DCL4/DRB4活性，而FVE-8能够劫持 dsRNA以阻止DCL4/DRB4作用产生siRNA。

原文链接：

https://advances.sciencemag.org/content/7/32/eabf3898

来源：植物生物学