追踪胚胎发育有了“高精度导航图”

生命伊始，精子和卵子相结合，产生受精卵，细胞开始分裂，生命的画卷自此展开，潜滋暗长形成各种功能完备的组织器官。在此过程中，细胞是如何沿着既定的“命运轨道”发展的？

为打开胚胎发育的“暗箱”，中科院遗传与发育生物学研究所（以下简称遗传发育所）杜茁研究组在单细胞水平上绘制了一份蛋白质图谱，它就像一张高精度导航图一样，揭示了胚胎发育过程中细胞实时调控的奥秘。相关成果7月26日发表于《自然—方法学》。

一份了解胚胎发育的分子图谱

生命体的构建始于胚胎发育，其调控动态复杂。

“发育图式如何建立，即受精卵产生的各个细胞如何获得特定命运，并建成形态功能完备的组织器官，是胚胎发育的核心问题。”遗传发育所研究员、论文通讯作者杜茁对记者说。

上世纪七八十年代，发育生物学先驱John Sulston通过绘制秀丽线虫全部体细胞的发育起源和谱系关系，首次揭示了一个多细胞动物整个发育过程的细胞图谱，在单细胞水平系统刻画了发育图式建立过程。线虫也因此成为高精度解析发育动态调控的先导模式动物。

然而，参与发育的细胞的分子特征尚未完全阐明，其内部的分子动态调控过程研究仍有待深入。

“一个切入点是阐明各个细胞在各个时刻的基因表达和调控。”长期从事基因时空动态表达与发育调控相关研究的杜茁表示，当前单个细胞的转录组测定已成为可能，但如何将转录组与细胞身份精确对应，达到单细胞注释精度仍十分困难。如何进一步提高表达分析的时间精度和维度，实现原位、实时、连续解析蛋白的动态变化也有待探索。

利用蛋白质融合荧光报告系统和四维实时成像技术，杜茁研究组绘制了一份蛋白质图谱，就像GPS实时导航图一样，它包含了线虫胚胎发育期间几乎所有细胞谱系中数百个转录因子的原位动态表达。基于此，研究者在转录因子单细胞蛋白动态表达和命运图式建立调控规律解析方面取得新进展。

动态揭示细胞“命运”

在胚胎发育过程中，细胞究竟是如何走上不同的“命运轨道”、发育成不同的器官、发挥不同作用的呢？

通过聚焦发育调控关键基因——转录因子，杜茁研究组在新研究中构建了数百个可指示蛋白动态表达的荧光报告品系，综合活体成像、细胞鉴定、实时谱系追踪、单细胞荧光定量分析，在原位、4D、单细胞水平解析了转录因子在各个细胞中的蛋白动态表达。

作者采用非损伤方式，通过成像和细胞追踪对细胞身份予以精确判定，并系统整合多个蛋白的单细胞表达水平，实现了真正意义上的单细胞注释精度的蛋白动态表达解析。

“这是一篇非常优质的论文，描述了266个转录因子蛋白的表达模式。关键是，这些基因报告器是由fosmid（质粒克隆）重组或CRISPR插入内源性位点产生的，绿色荧光蛋白直接与转录因子蛋白融合。”一位审稿人评价称，“这对科学界的相关研究有着巨大价值。”

利用该图谱，作者首先从多维度解析了细胞命运图式建立的分子调控框架。研究发现，转录因子在四个层级——谱系来源、体轴定位、细胞类型、发育时间，通过时间和空间的部分重叠和交错组合，逐步赋予不同细胞各异的调控状态。

“每个层次的区分均涉及多个表达部分相似的不同转录因子，赋予调控过程高度稳固性。”论文共同第一作者、杜茁研究组助理研究员马雪华说，计算模拟显示，去除数十个转录因子仅对图式建立的精确度造成有限影响。该结果初步揭示了错综复杂的命运图式逐级建立过程的调控逻辑。

为理解转录因子发育功能，研究整合了单细胞表达相似性和基于实验数据的转录因子—靶基因信息，构建了时空特异性调控回路，涵盖161个发育时空模块中8000多个转录因子间的调控关系，并基于此揭示了经典调控基因的新功能和新发育调控过程。

对此，另一位审稿人指出，作者之所以能够识别出胚胎发育的调节因子，是因为运用了许多先进的研究方法，该蛋白图谱可进一步与单细胞测序、ChIP-Seq（可在全基因组范围内对蛋白质结合位点进行高效准确筛选与鉴定的方法）、功能实验等相结合。由此获得的单细胞蛋白动态表达图谱“还可以被进一步用于推导出可被实验验证的新假说”。

引领发育调控新认知

不只是绘制“地图”，研究者还希望“按图索骥”，为模拟和解析细胞调控状态与细胞命运的动态关系提供帮助。

基于高时空精度的分子与细胞图谱的整合，研究者系统探究了细胞调控状态的多样性和复杂性。结果发现，调控状态随谱系展开呈现出高度差异化，尽管同类组织细胞在随后发生趋同，但仍呈现高度依赖于谱系来源的状态多样性。

“因此，细胞的发育历史对其最终功能的塑造有着不可忽略的影响，而谱系的组织方式决定了同类细胞状态及功能的多样性。”论文共同第一作者、博士研究生赵志广说。

研究进一步发现，细胞调控状态随发育持续变化直至终末分裂，其转变轨迹高度非定向，提示沃丁顿发育地貌蜿蜒曲折，细胞历经多个中间状态，通过长时间的 “绕路” 到达终点。

作者表示，该研究为解析胚胎发育的分子调控规律提供了完整、精确和标准化的参考信息，为“表达启示型”基因发育功能研究、调控状态—功能定量生物学研究、单细胞—全胚胎—多维度系统生物学研究奠定基础。

“对于‘高等’模式动物，单细胞分析或为一新兴领域，而线虫发育生物学进入单细胞时代已逾四十载。”杜茁说，“我们的研究提示，即便是仅由千余个细胞构成的 ‘简单’生物，人类对其发育调控动态性、多样性和复杂性的认知也才刚刚开始。”

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41592-021-01216-1