​开辟单细胞测序新领域，Live-seq助力实现单个活细胞转录组的动态连续分析

生物学中最基本的三个问题是单个细胞如何分化形成组织，组织如何以协调和灵活的方式运作，以及哪些基因调控机制支持这些过程。大多数生物过程本质上都是短暂的动态过程，细胞的状态会根据内部程序或外部刺激而变化，我们身体中许多不同类型的细胞都来自一个受精卵这一事实就完美地证明了这一点。因此，对于生命的探索，一件非常重要的事情在于，不仅要了解细胞的现有状态，而且要了解细胞达到这种状态的过程，即它的分子历史，它可以确保正常的发育或在偏离正常标准时引起疾病。然而，揭示细胞的分子历史仍然存在显著的技术困难。

令人兴奋的是，为了实现对细胞分子历史的探索，研究人员已经逐渐开发出一些新方法，如工程基因电路、基于重组酶和CRISPR的DNA编辑系统和活细胞成像，但是，这些方法最大的局限性就在于它们只能记录单个细胞的单一或几个事件，而不能提供细胞分子状态的全面视角【1】。当然，不必气馁，单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术的发展为上述策略提供了高度互补，因为它可以根据无偏倚的转录组学数据来推断细胞的历史和轨迹，极大地提高了我们在健康和疾病状态中描述细胞异质性的能力。这种基于scRNA-seq的轨迹推断方法主要基于这样一个原理——不同阶段的细胞群快照可以反映单个细胞随时间的分子变化。scRNA-seq的应用及其扩展应用已经提供非常多的生物学见解，然而我们依旧不能忽视其一个基本的局限性——对于一个测量的细胞状态的分布可能存在多种导致它们产生的潜在动态【2,3】。因此，确切来说，这些工具产生的模型应该被解释为统计上的预期，而不是细胞的实际过渡途径。这也就在一定程度上解释了为什么不同的方法经常会对同一数据集产生不同的细胞轨迹预测，这也表明精确的轨迹推断仍是单细胞数据科学的重大挑战之一。此外，尽管scRNA-seq技术已经经历了一个显著的转变，从最初只对少数细胞进行分析到如今一次处理数千个或更多的细胞，但这些技术都有着相同的实验缺点——它们只允许进行终点测量，因为它们需要细胞裂解，这不仅具有破坏性，而且也使得单个细胞与下游分子和表型状态的联系成为不可能。

基于以上，近日，来自瑞士洛桑联邦理工学院的Bart Deplancke团队在BioRxiv上在线发表文章 Genome-wide molecular recording using Live-seq ，创立了一种利用射流力显微镜在RNA提取过程中保持细胞活力的单细胞转录组分析方法——Live-seq，证明了Live-seq可以在保持细胞存活的同时对单细胞转录组进行分析，从而可以直接对被检测细胞进行下游功能分析；此外，Live-seq可用于连续分析相同单个细胞的转录组，提供细胞动力学的直接读出。由此表明Live-seq可以作为转录组记录器，将细胞过去的转录组与其下游细胞表型联系起来，从而将scRNA-seq从终点测量转换为瞬时分析方法而解决更广泛的生物学问题。

射流显微镜（FluidFM）可以以一种可调节的方式对细胞总RNA含量的一小部分进行取样，因此为了保证细胞活性，研究人员优化FluidFM RNA提取过程以进行细胞质穿刺，从而获得pg级别甚至pg以下级别的RNA量。与此同时，由于Smart-seq2被广泛认为是检测低量RNA的最敏感的RNA-seq方法之一，研究人员也评估了其是否能够以预期的pg级RNA扩增cDNA，并系统地优化了每一步流程的效率。由此，本文研究人员将基于FluidFM的细胞质取样与增强的低输入RNA分析工作流程相结合（图1），构成了Live-seq的方法论基础，并且初步证明了利用细胞质穿刺进行转录组分析的潜力。

图1 Live –seq结合了优化的基于FluidFM的活细胞穿刺(a)和增强的Smart-seq2 RNA-seq(b)

为了评估Live-seq细胞转录组的细胞特性甚至细胞状态分辨能力，研究人员将该方法应用于不同的细胞类型，包括永生化棕色前脂肪细胞（IBA）、小鼠原代脂肪干细胞和祖细胞（ASPC）以及两类单核/巨噬细胞样RAW264.7细胞系（统称为RAW细胞）。同时为了确定Live-seq研究细胞状态转变的能力，研究人员用脂多糖（LPS，革兰氏阴性细菌的外膜成分，能够激活单核细胞和巨噬细胞）或者对照试剂分别处理RAW细胞。结果发现Live-seq数据可以被分为明显的4类，细胞类型和处理在很大程度上决定了文库的复杂性（检测到的基因数量）、重复特性或RAW细胞亚系，证明Live-seq可以有效分析原代和培养细胞的能力。而且利用传统的scRNA-seq对同样的四类细胞进行全细胞测序，可以发现其结果与Live-seq的结果类似，由此证明Live-seq能够实现与传统的scRNA-seq类似细胞类型和状态的精确分层，并且不需要裂解细胞。

上述分析证实Live-seq可以与广泛使用的常规全细胞转录组分析方法相提并论，但是Live-seq的设计宗旨是微创、保存细胞活性，并允许对同一细胞进行连续监测。因此，为了进一步确定Live-seq的这些功能，研究人员首先在取样后评估了细胞的生存能力。结果显示在Live-seq取样后，所有类型的细胞都具有较高的细胞活性，表明在提取了部分细胞质成分后，细胞也能够很快地恢复，而且Live-seq并不会引起短期内基因表达的重大改变。同时细胞在经过细胞质穿刺后能很快恢复其本来的大小，且继续分裂增殖（图2）。由此证明Live-seq能够在不影响细胞基本特性（如生存能力、转录组或生长）的情况下对细胞转录组进行分析，从而开辟了一条将细胞分子状态与其当前和未来表型特性直接联系起来的新途径。

图2 延时显微镜记录Live-seq提取后RAW细胞的分裂

众所周知，巨噬细胞（包括本文中使用的RAW细胞）对LPS的反应是不均一的，但是驱动这种异质性的分子因素的系统性、全基因组分析还未进行。因此本文研究人员试图利用Live-seq分析单个RAW细胞，以期将每个巨噬细胞的分子状态与其下游LPS诱导的表型联系起来。实验结果获得了基于影响巨噬细胞LPS反应异质性的能力的基因的全基因组排序，揭示了NFKBIA的基础表达水平和细胞周期状态是主要的表型决定因素。此外，研究人员还发现利用Live-seq在LPS刺激前后连续采样，可以获得同一细胞的转录组动力学，从而实现对细胞轨迹的直接定位。

综上所述，本文通过将增强的基于FluidFM的活细胞穿刺技术与高度敏感的RNA-seq方法相结合来建立Live-seq，其能够在保持细胞活性和功能的同时区分细胞类型和状态，从而用于解决多种多样的生物学问题，尤其是作为一种转录组范围的记录工具来解决细胞异质性的分子决定因素。总之，Live-seq通过在不同的时间点对同一细胞进行单细胞转录组分析和下游分析，开辟了单细胞测序的新领域，有望将目前的终点类型分析转变为瞬时分析工作流程。

参考文献

1. Sheth, R. U. & Wang, H. H. DNA-based memory devices for recording cellular events. Nature Reviews Genetics 19, 718–732 (2018).

2. Tanay, A. & Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature 541, 331–338 (2017).

3. Tritschler, S. et al. Concepts and limitations for learning developmental trajectories from single cell genomics. Development 146, (2019).

来源：BioArt植物