伴侣样蛋白DAY调控光形态建成的双重角色

2021年7月7日，Nature Communications在线发表了韩国延世大学Hyun-Sook Pai教授和奥地利科学院孟德尔研究所Youssef Belkhadir教授为共同通讯作者的题为“Chaperone-like protein DAY plays critical roles in photomorphogenesis”的研究论文。该研究揭示了含有DnaJ-like结构域的膜蛋白DAY，通过稳定BR受体BRI1以及叶绿素生物合成中的关键酶POR，从而在光形态建成中发挥双重作用。

研究背景

光形态建成是所有陆生植物的基本特征，该过程依赖于油菜素甾醇（BR）、赤霉素（GA）和生长素信号转导。BR作为光形态建成的重要抑制因子之一，在种子萌发后至幼苗出土前的暗形态建成中发挥重要调控作用。叶绿素发育是光形态建成的重要参与者，光依赖型原叶绿素酸酯氧化还原酶POR（Pchlide oxidoreductase）是叶绿素生物合成途径中的关键调控蛋白。前期研究发现POR伴侣样蛋白CPP1可通过增强烟草和拟南芥POR蛋白的稳定性来促进叶绿素生物合成和叶绿体生物发生。对拟南芥中编码CPP1的同源基因At3g51140进行敲降导致黑暗中幼苗去黄化和光照下叶片黄化，因此将其命名为DE-ETIOLATION IN THE DARK AND YELLOWING IN THE LIGHT（DAY）。该基因编码蛋白具有DnaJ/Hsp40型辅助伴侣的DnaJ-like（JL）结构域，预测具有伴侣活性，并可能是光形态建成的多功能调控因子。

研究结果

1.DAY促进光形态建成

由于无法获得day纯合突变体，故利用地塞米松（DEX）诱导型DAY RNAi（DAYi）来分析DAY缺陷对拟南芥的影响。DEX添加后，黑暗中生长DAYi幼苗表现出去黄化表型，包括下胚轴变短和子叶开放，并对BR生物合成抑制剂丙环唑（PPZ）敏感。外源芸薹素内酯（BL）或bikinin处理可部分恢复DAYi植株缩短的下胚轴和去黄化表型，表明DAY促进了BR信号转导。此外，将DAY敲降株系从黑暗转移到光照条件下时表现出子叶绿化降低，这种去黄化受损与黑暗中POR丰度降低以及从黑暗到光照转变期间的叶绿素A/B结合蛋白（CAB）积累异常相关。这表明DAY独特且特异地参与两个不同的光形态建成过程（图1）。

图1. DAY在光条件下促进子叶发育，在黑暗中促进BR信号转导

2. DAY的多亚细胞定位

叶绿素生物合成和BR信号转导级联发生在不同的亚细胞区室，为明确DAY发挥功能的场所，首先对其氨基酸序列进行分析发现包含一个叶绿体转运肽（cTP），它在从细胞质到叶绿体的易位过程中被切割，一个与伴侣活性相关的JL结构域和4个跨膜结构域。荧光显微观察显示，DAY定位于质膜，而且与叶绿体、反面高尔基体网状结构/早期内体系统（TGN/EE）和内质网（ER）共定位，表明DAY定位于叶绿体和内膜系统。进一步分析表明，DAY蛋白以两种形式存在，第一个跨膜结构域和cTP区域对于将DAY分别靶向内膜系统和叶绿体至关重要。

3.DAY结合并稳定POR

 DAY敲降导致POR水平降低并抑制叶绿体发育，通过激光共聚焦显微观察发现DAY蛋白对于维持叶绿体完整性和拟南芥光照后的主要POR亚型（POR C）积累至关重要。体外检测结果表明DAY具有伴侣活性，JL结构域的存在是其活性发挥的关键。BiFC以及体外pull-down实验结果显示，DAY与POR C互作，且叶绿体中DAY的以其伴侣活性稳定POR C蛋白。

4.DAY改变BRI1稳定性并增强BR信号转导

在DAY敲降拟南芥根系中BRI1-GFP显示积累。尽管在体外激酶反应中添加DAY不影响BRI1活性，但在光照下生长的DAY敲降株系的免疫印迹显示BRI1水平降低以及BZR1磷酸化增加，结合遗传证据表明DAY通过作用于BRI1促进BR信号转导（图2）。互作验证显示DAY直接与BRI1的胞质激酶结构域互作，但不与其胞外结构域互作。为明确BRI1与DAY互作的胞质区域，通过体外结合试验发现，BRI1激酶结构域的N端半段结构以及DAY的cTP区域可能对于DAY 和BRI1激酶结构域之间的互作至关重要。

图2. DAY调控BRI1稳定性

一图解文

DAY介导的BR信号转导和叶绿素生物合成对于光形态建成至关重要。DAY分别结合并稳定内膜系统中BRI1和叶绿体中的POR。cTP序列是将DAY转移到叶绿体内被膜的关键，并且第一个跨膜结构域是DAY在ER、TGN/EE和质膜中定位所必需的。

图3. DAY在不同的亚细胞区室中稳定BRI1和POR的工作模型