史上新高CRISPR基因编辑插入效率！

来源：生物通

CRISPR-Cas9基因编辑系统将基因插入人细胞的效率一直不高，直到Huimin Zhao教授团队化学修饰插入DNA的5'端，使得基因插入效率达到史上新高——可高达原来的5倍之多！赶快看看

伊利诺伊州尚帕尼市-伊利诺伊大学的研究人员使用CRISPR-Cas9基因编辑系统将基因插入人细胞，插入效率创史上新高（根据已有报告）。成功率高是利用CRISPR进行临床基因治疗应用的必要步骤。

通过化学修饰待插入DNA的末端，新技术的效率可达到当前方法的五倍。研究人员发现，在人类肾脏293T细胞系中不同的遗传位点的测试情况都得到了改善，在其中一个位点的插入率达到了65％，而之前的最高水平才15％。该研究是在化学和生物分子工程教授Huimin Zhao的带领下进行的，刚刚发表在《Nature Chemical Biology》杂志上。

CRISPR是关闭或“敲除”基因的有效工具。但是，在人类细胞中，插入或“敲入”基因的效率并不算高。

负责伊利诺伊州卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所生物系统设计主题的Zhao说：“一种好的基因敲入方法（knock-in）对于基因治疗应用和研究基因功能的基础生物学研究都很重要。。。利用基因敲入（knock-in），我们可以在任何基因上添加标签，研究其功能，并查看基因表达怎样受到癌症或染色体结构变化的影响。或者在基因治疗应用中，如果某人患有由缺失基因引起的疾病，我们希望能够插入它。”

为了寻找提高效率的方法，Zhao的小组研究了13种不同的方法来修饰插入的DNA。他们发现，DNA末端的微小变化能够同时增加插入的速度和效率。

研究人员尝试使用CRISPR-Cas9精确靶向插入的特定位点，将不同大小的5’末端修饰的DNA片段（0.7kb-2.5kb）连同50个碱基的同源臂，插入人类胚胎肾293T细胞的基因组中的多个位点，获得前所未有的65%-40%的插入效率。即使插入较大的DNA片段——这是最难插入的片段，效率也提高了2至5倍。他们证实，这种5’端修饰使得在人癌细胞和干细胞的不同位点的插入效率提高可达5倍。

“我们推测，由于末端的化学修饰稳定了插入的DNA，插入效率提高了很多，”赵教授说。 “通常，当尝试将DNA转移到细胞中时，它会被酶从末端开始降解。我们认为我们的化学修饰可以保护DNA末端。更多的DNA进入细胞核，并且DNA更稳定，所以这就是为什么我认为它有更高的机会整合到染色体中。”

赵的研究小组已经在基因功能研究中使用该方法标记关键的基因。他们特意使用现成的化学试剂来修饰DNA片段，以便其他研究团队可以将相同的方法用于自己的基因研究。

“我们过去已经开发了很多敲入方法，但是我们从未想过仅使用化学试剂修饰来增加我们想要插入的DNA的稳定性，”赵说。 “这是一个简单的策略，但是有效。”

参考文献：

An efficient gene knock-in strategy using 5'-modified double-stranded DNA donors with short homology arms