PNAS：郭行团队揭示26S蛋白酶体新调控机制

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蛋白酶体对于真核细胞生存的意义众所周知，但其自身如何被调控是长期以来被忽视的重要问题。26S蛋白酶体于1987年被发现，其后不久（1989年）就有报导表明蛋白酶体上存在磷酸化修饰，但直到最近10年蛋白酶体磷酸化修饰的生物学功能才逐渐为人们所认识。现有的质谱结果显示，人源26S蛋白酶体所有亚基上存在超过450个磷酸化位点（pS/pT/pY），其中功能和调控机制明确的屈指可数 (Guo et al., 2017)。2011年郭行团队发现了第一个蛋白酶体磷酸酶UBLCP1，证明生理情况下蛋白酶体存在可逆磷酸化。UBLCP1是人类基因组中唯一一个含有Ubiquitin-like (UBL)domain的磷酸酶，通过其UBL domain直接与蛋白酶体的底物识别亚基之一Rpn1结合。UBLCP1可以去磷酸化蛋白酶体、限制蛋白酶体的组装从而降低蛋白酶体活性(Guo et al., 2011)。但UBLCP1直接作用的磷酸化位点以及它调控蛋白酶体组装的分子机制尚不清楚。

近日，PNAS在线发表了浙江大学生命科学研究院郭行教授团队的研究成果：Reversible phosphorylation of Rpn1 regulates 26S proteasome assembly and function。研究进一步揭示了UBLCP1对蛋白酶体亚基Rpn1的磷酸化位点，展示了该磷酸化对蛋白酶体功能和细胞稳态平衡的影响。

在与UC-Irvine的Lan Huang教授课题组合作过程中，他们发现UBLCP1在体外可以催化Rpn1-S361位点的去磷酸化。针对此位点制备了磷酸化特异性抗体，并证明Rpn1-S361是一个广泛存在的蛋白酶体磷酸化位点。为了研究Rpn1-S361位点磷酸化的功能，作者利用CRISPR/Cas9技术在细胞中敲入S361A突变。与对照细胞相比，S361A细胞的蛋白酶体活性下降，细胞活力降低，表明Rpn1-S361磷酸化对维持蛋白酶体的正常功能有重要作用。

郭行团队进一步与北京蛋白质中心的徐平课题组合作，利用SILAC技术对Rpn1-WT/SA细胞进行全蛋白质组的定量质谱分析，意外发现有大量线粒体和内质网相关的蛋白在SA细胞中显著累积。在UC-San Diego的Jack E. Dixon实验室帮助下，他们确证Rpn1-S361A突变引起细胞中线粒体的形态异常和功能受损，胞内氧化还原状态失衡，更加佐证了Rpn1-S361磷酸化对于细胞生理的重要性。

细胞实验进而表明Rpn1-S361去磷酸化是UBLCP1调控蛋白酶体功能的主要途径。同时，Ublcp1敲除小鼠中Rpn1-S361磷酸化水平升高，再次证明Rpn1是UBLCP1的真实底物。通过对人类激酶组cDNA的筛选，发现有多个激酶可以在体外直接磷酸化Rpn1-S361。其中，PIM家族的PIM1/2/3同时敲除可以明显降低（但不能完全消除）细胞内的Rpn1-S361磷酸化，并下调蛋白酶体活性。

与UBLCP1抑制蛋白酶体组装一致，Rpn1-S361A细胞中完整的26S蛋白酶体含量降低。同时，包含Rpn1的蛋白酶体组装前体复合物（Rpn1-Rpt2-Rpt1）也明显减少，说明S361磷酸化在蛋白酶体组装的最早阶段就起到重要作用。Rpt2是蛋白酶体另一个重要亚基，与Rpn1直接结合。Rpt2 N-端有一串进化中高度保守的赖氨酸(poly-K)序列，参考蛋白酶体的高分辨率电镜结构，推测其与磷酸化的Rpn1-S361可以发生直接相互作用。在浙江大学生命科学研究院林世贤课题组的帮助下，利用遗传密码子拓展和非天然氨基酸标记技术，纯化得到在S361位点带有磷酸化修饰的Rpn1蛋白。体外蛋白结合实验显示，S361磷酸化极大地增强了Rpn1与Rpt2的结合，并且这一效果严格依赖于Rpt2 N-端的poly-K序列。这种静电相互作用促进了Rpn1-Rpt2-Rpt1前体复合物的形成并进而推动蛋白酶体的整体组装。

总结来说，研究发现了一种全新的蛋白酶体调控机制，并在分子层面给出了蛋白酶体磷酸化调控的最清晰解释，揭示了蛋白酶体修饰与线粒体功能间的密切关系。PIM等Rpn1-S361激酶的发现拓展了对蛋白酶体调控因子的认识，为干预蛋白酶体功能提供了新的可能性。郭行实验室博士生刘晓妍和徐平实验室博士生肖伟弟是本文的共同第一作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1073/pnas.1912531117

参考文献

1. Guo, X., Engel, J.L., Xiao, J., Tagliabracci, V.S., Wang, X., Huang,L., and Dixon, J.E. (2011). UBLCP1 is a 26S proteasome phosphatase thatregulates nuclear proteasome activity. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 18649-18654.

2. Guo,X., Huang, X., and Chen, M.J. (2017). Reversible phosphorylation of the 26Sproteasome. Protein & cell 8,255-272.