深度打击潜伏的HIV！

目前，针对人免疫缺陷病毒（HIV）感染者的治疗主要依靠抗反转录病毒疗法（ART），虽然ART能有效抑制病毒复制，使感染者体内的病毒控制在无法检测的水平，显著延长了他们的寿命，但无法完全消除HIV，感染者的体内仍然存在病毒储存库[1]。

 另外，HIV具有高变异率的特点，常常能够逃避免疫系统的追杀，这也是无法根除HIV的主要障碍。然而，潜伏的HIV可能与慢性炎症有关，会诱发诸如心血管疾病，糖尿病和恶性肿瘤疾病等[2]。到目前为止，HIV感染没有治愈的特效药，患者需终身服用药物来抑制病毒复制。因此，找到彻底消除HIV的药物，是全世界研究者们都在努力的事。

近日，来自华盛顿大学医学院Shan Liang领衔的研究团队在《科学》杂志上发表重要研究成果。他们发现，原来人的细胞中有一个HIV-1感染的“警报器”——CARD8，它作为炎性小体感受器，可识别具有活性的HIV-1蛋白酶，启动由其介导的程序性细胞死亡，以此来清除感染HIV-1的细胞。

HIV-1蛋白酶是病毒复制过程中关键酶之一，它的活化能使HIV-1变成具有感染性的成熟病毒，通过抑制它，可阻止病毒复制。因此，HIV-1蛋白酶是治疗HIV-1感染的靶点之一。而此次研究不同于以往“阻止复制”的治疗策略，而是通过提前活化细胞内的HIV-1蛋白酶，从而启动细胞程序性死亡，直接杀死感染细胞。

 那研究团队是如何发现CARD8这一“报警器”呢？我们知道，在大多数情况下，机体通过细胞内受体识别不同危险的刺激信号，从而引起抗感染的级联反应。其中， NLRP1是能形成炎症小体的受体，其含有未知功能的FIIND结构域和CARD结构域，因涉及的信号通路与许多疾病都息息相关，是被众多科学家研究的对象[3]。

研究发现，小鼠中NLRP1b N端，能被炭疽芽孢杆菌致死因子蛋白切割，之后引起炎症小体组装和激活Caspase-1（CASP1）下游信号，使细胞发生程序性死亡[4-5]。而人的CARD8与鼠的NLRP1结构相似，且CARD8具有在淋巴组织中高表达的特点，与CD4+T细胞和巨噬细胞的炎性体活化有关[6-7]。

这表明在淋巴组织中，CARD8作为炎性小体感受器可有效发挥作用，而CD4T细胞是HIV-1感染的关键细胞。研究人员据此猜测，CARD8炎性小体可能是一个HIV-1感染的“警报器”，可触发感染细胞的死亡。

 为了验证这一猜测，他们开展了一系列实验。首先，他们构建了用HIV-1感染表达CARD8的人肾上皮细胞（HEK293T），发现CARD8的N端被HIV-1蛋白酶切割了两次，而在感染突变的HIV-1细胞中（HIV-1蛋白酶无活性），CARD8的N端则无法被切割。研究者认为，CARD8是无法检测没有活性的HIV-1蛋白酶的。

通常情况下，被感染细胞中的HIV-1为了更好地潜伏，都会使蛋白酶不具活性，只有离开受感染的细胞后，HIV-1蛋白酶才会活化，这也就意味着HIV-1蛋白酶不仅逃过了细胞内CARD8的监测，还开始繁衍自己的后代了。那如果能在感染细胞内活化蛋白酶，就能拆穿HIV-1的诡计，靶向消灭它。 

幸运的是，在2006年有报道称，临床上治疗感染HIV的非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTIs）药物，如利匹韦林(RPV)和依非韦伦(EFV)，可增强细胞内Gag-Pol多蛋白二聚作用，引起潜伏的HIV-1蛋白酶活化[8]。

图片来自pexels.com

根据这一思路，研究者用RPV处理了被HIV-1感染的含有CASP1和促IL-1β表达的质粒的HEK293T细胞，促炎因子IL-1β能正常分泌，它是引起免疫反应和细胞焦亡的关键分子。但加入蛋白酶抑制剂洛匹那韦 (LPV)或敲除CARD8后，这种现象被阻断了。这些结果证明，在RPV作用下，HIV-1蛋白酶被活化后切割CARD8 N端，诱导IL-1β的分泌。

那NNRTIs在人免疫细胞中是否也与HEK293T细胞中一样，能够通过激活HIV-1蛋白酶，引发CARD8警报呢？CARD8警报“响起”后，这类感染细胞又能否死亡？如果能成功的话，那就意味着人类有可能清除潜在的HIV-1。

确实有研究发现，NNRTIs可引起存在潜伏HIV-1的CD4+ T细胞的死亡，但是其中的机制还不清楚[9-11]。基于综上研究，他们猜想感染细胞的死亡是由NNRTIs活化HIV-1蛋白酶引起的，并通过CARD8炎性小体感受器激活CASP1，从而发生细胞死亡。

因此，研究团队用HIV-1感染人扁桃体组织中的原代CD4+ T细胞以及血液中单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs），从不同角度证明了自己的猜测：

首先，用EFV、RPV、LPV或组合的方式处理感染的MDMs，结果显示，HIV-1蛋白酶活化会引发细胞死亡，并且细胞杀伤效果随时间增加而加强，而LPV能够抑制这一现象的发生。与此同时，他们还检测了与CASP1激活启动细胞死亡程序的关键因子IL-1β、p10和p20，结果显示，RPV成功激活了CASP1介导的程序性细胞死亡。相似的结果也出现在CD4+ T细胞中。

RPV处理的细胞相比对照（DMSO），细胞中CASP1被激活的百分比更高（H），死亡的感染细胞更多（I、J），但是在敲除了CARD8（CARD8 KO）或敲除了CASP1（CASP1 KO）的细胞中效果显著减弱

随后，在两类细胞中分别采用加入CASP1抑制剂、蛋白酶抑制剂以及敲除CARD8或敲除CASP1的方法，都同样出现了抑制IL-1β分泌及减少细胞杀伤的现象，证明了其推测。

结合之前的结果，研究团队将该方法用于临床感染的病人中。他们从接受ART的八位感染者体内获得血液CD4+ T细胞，用EFV和RPV处理后，发现所有患者体内感染HIV-1的细胞都显著减少了，并且有三名患者没有检测到病毒，证明了该机制清除了大部分潜在的HIV-1。 

研究团队还证明了，在一些主要的HIV-1亚型中，该机制都可触发感染细胞的死亡，包括北美，欧洲，非洲和亚洲常见的菌株。说明了该机制的普适性，对HIV-1的治疗策略具有直接的影响。

HIV-1感染者获取CD4+ T细胞后的处理方案（D）和结果（E），相比对照组（control），RPV组的感染细胞明显减少，红色为2.5μM剂量处理2天，蓝色为5μM剂量处理3天

总的来说，该机制在一定程度上解决了HIV-1因高变异率而逃过免疫系统追杀的问题。免疫系统就像一位狙击手，在NNRTIs的帮助下，无论HIV-1突变程度如何，都可通过识别活化的HIV-1蛋白酶，而迅速击杀。

该研究提示我们在治疗患者初期，采用无蛋白酶抑制剂的NNRTIs，可减少HIV-1在体内的病毒库。此外，可进一步研究NNRTIs这类药物激活潜伏HIV-1的过程，从而开发出低剂量和快速杀伤细胞的特效药，为艾滋病患者带来治愈的希望。

未来，进一步探索CARD8炎性体能否识别其他病毒蛋白酶，也可以为其他一些病毒感染类疾病提供新的治疗思路。

参考文献：

[1] Kabir MA, Zilouchian H, Caputi M, Asghar W. Advances in HIV diagnosis and monitoring. Crit Rev Biotechnol. 2020;40(5):623-638. doi:10.1080/07388551.2020.1751058.

[2] Costiniuk CT, Jenabian MA. Cannabinoids and inflammation: implications for people living with HIV. AIDS. 2019;33(15):2273-2288. doi:10.1097/QAD.0000000000002345.

[3] Lamkanfi M, Dixit VM. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 2014;157(5):1013-1022. doi:10.1016/j.cell.2014.04.007

[4] Sandstrom A, Mitchell PS, Goers L, Mu EW, Lesser CF, Vance RE. Functional degradation: A mechanism of NLRP1 inflammasome activation by diverse pathogen enzymes. Science. 2019;364(6435):eaau1330. doi:10.1126/science.aau1330

[5] Chui AJ, Okondo MC, Rao SD, et al. N-terminal degradation activates the NLRP1B inflammasome. Science. 2019;364(6435):82-85. doi:10.1126/science.aau1208

[6] Linder A, Bauernfried S, Cheng Y, et al. CARD8 inflammasome activation triggers pyroptosis in human T cells. EMBO J. 2020;39(19):e105071. doi:10.15252/embj.2020105071

[7] Johnson DC, Okondo MC, Orth EL, et al. DPP8/9 inhibitors activate the CARD8 inflammasome in resting lymphocytes. Cell Death Dis. 2020;11(8):628. Published 2020 Aug 14. doi:10.1038/s41419-020-02865-4

[8] Figueiredo A, Moore KL, Mak J, Sluis-Cremer N, de Bethune MP, Tachedjian G. Potent nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors target HIV-1 Gag-Pol. PLoS Pathog. 2006;2(11):e119. doi:10.1371/journal.ppat.0020119

[9] Jochmans D, Anders M, Keuleers I, et al. Selective killing of human immunodeficiency virus infected cells by non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor-induced activation of HIV protease. Retrovirology. 2010;7:89. Published 2010 Oct 15. doi:10.1186/1742-4690-7-89

[10] Zerbato JM, Tachedjian G, Sluis-Cremer N. Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors Reduce HIV-1 Production from Latently Infected Resting CD4+ T Cells following Latency Reversal. Antimicrob Agents Chemother. 2017;61(3):e01736-16. Published 2017 Feb 23. doi:10.1128/AAC.01736-16

[11] Trinité B, Zhang H, Levy DN. NNRTI-induced HIV-1 protease-mediated cytotoxicity induces rapid death of CD4 T cells during productive infection and latency reversal. Retrovirology. 2019;16(1):17. Published 2019 Jun 26. doi:10.1186/s12977-019-0479-9

来源：奇点网